陳鎮(zhèn)秋 洪郭駒 韓曉蕊 何偉 張慶文 魏秋實(shí)*

1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，廣東廣州510405

2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)中心國家重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510405

3．加拿大阿爾伯塔省埃德蒙頓阿爾伯塔大學(xué)醫(yī)學(xué)院外科部，T6G 2R3

4．廣州市第一人民醫(yī)院/華南理工大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射科，廣東廣州510006

血管形成與組織內(nèi)血管化由多種細(xì)胞協(xié)同作用，主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelia cell，EC)和周細(xì)胞(pericyte)［1］。血管內(nèi)皮細(xì)胞是組織表面的單層扁平上皮，具有構(gòu)成血管腔結(jié)構(gòu)、吞噬異物、集體免疫等功能［2-3］。周細(xì)胞又稱Rouget細(xì)胞，它通常存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的基膜中，通過直接接觸或者旁分泌信號(hào)，與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞間的生物學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而監(jiān)視和穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞的成熟過程［4］。血管化在骨組織重建中發(fā)揮重要作用，血管網(wǎng)通過激活骨內(nèi)細(xì)胞，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞吸收，促進(jìn)成骨細(xì)胞生成新骨，從而維持骨穩(wěn)態(tài)平衡［5］。成功的藥物運(yùn)用，可透過血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，在骨組織中發(fā)揮重要作用。然而，在目前的藥物研發(fā)中，化學(xué)類藥物能夠發(fā)揮這一作用的較為局限，且副作用較多［6］。

活血化瘀類中藥運(yùn)用于臨床由來已久，且作用顯著，可用來增強(qiáng)骨血管化治療效果。其中，祛痰逐瘀方(Qutan Zhuyu Decoction，QZD)由經(jīng)典方劑四物湯和二陳湯有機(jī)組合而成，已被證明具有多項(xiàng)臨床藥理作用，如心腦血管等疾?。?-8］。在既往的研究中，本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)從細(xì)胞層面和病理層面報(bào)道了QZD可以保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪化，從而提高移植后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率［9-10］。然而，QZD在血管的修復(fù)重建、血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙和增殖作用上知之甚少，限制了QZD在骨血管化的進(jìn)一步深入拓展。在本研究中，研究團(tuán)隊(duì)證明了QZD通過激活類絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管管腔形成。QZD可能是增加干細(xì)胞替代療法中細(xì)胞遷移的有希望的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究采用C57BL/6小鼠共30只。性別:雄性;級(jí)別:SPF級(jí)。體質(zhì)量230～250 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格編號(hào)為(SCXK(粵)2014-0035);所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心執(zhí)行，編號(hào)為(SCXK(粵)2013-0001)，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)鼠糧適應(yīng)性飼養(yǎng)，室溫(23±2)℃，自由飲水，間隔光照12 h，并保持定期消毒、通風(fēng)，各組小鼠按照單籠培養(yǎng)原則執(zhí)行。臨床和動(dòng)物倫理審查:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 復(fù)方QZD含藥血清制作

QZD 組成:熟地10 g、芍藥10 g、當(dāng)歸10 g、川芎10 g、半夏10 g、陳皮10 g、茯苓 10 g、甘草10 g，實(shí)驗(yàn)用中藥均統(tǒng)一購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。按照人與小鼠的劑量換算公式計(jì)算小鼠的每日灌胃劑量。上述藥物水煎加熱濃縮為濃度1 g/mL的藥液，4℃保存?zhèn)溆?。給藥前將小鼠禁食6 h后采用QZD藥液灌胃。1次/d，連續(xù)7 d。末次灌胃1 h后，水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血。室溫靜置30 min后取上清液，3 000 r/min離心，分離血清，取上清液。冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

培養(yǎng)SVEC細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞系，來自猿猴病毒轉(zhuǎn)化小鼠)和10 T1/2細(xì)胞(周細(xì)胞前體細(xì)胞，來自小鼠間充質(zhì)細(xì)胞系)(由University of Western Australia徐家科教授饋贈(zèng))。細(xì)胞維持在DMEM液中進(jìn)行培養(yǎng)。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中，在5%CO2和95%空氣的濕潤氣氛下及37℃下培養(yǎng)。將3～5次傳代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 劃痕遷徙實(shí)驗(yàn)

將SVEC細(xì)胞在24孔板中在DMEM(Sigma公司，美國)中培養(yǎng)。在劃痕前將細(xì)胞單層在無血清Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific公司，美國)中血清饑餓過夜。24 h后用移液管尖端刮擦融合細(xì)胞單層以產(chǎn)生劃痕傷口。然后用Opti-MEM洗滌細(xì)胞兩次以除去細(xì)胞碎片。在細(xì)胞中加入QZD含藥血清或bFGF蛋白(Thermo Fisher Scientific公司，美國)的Opti-MEM作為陽性對照在37℃溫育16 h。使用Nikon Eclipse TE2000-5顯微鏡在所選位置的0和16 h時(shí)間點(diǎn)捕獲時(shí)間流逝圖像，并且通過Image J軟件估計(jì)傷口區(qū)域。

1.5 管腔形成實(shí)驗(yàn)

在開始實(shí)驗(yàn)之前，將 SVEC細(xì)胞在無血清DMEM中血清饑餓過夜。將Matrigel Matrix(Corning公司，美國)在4℃下解凍過夜，然后使用。24 h后，將基質(zhì)膠基質(zhì)加入24孔板(300 μL/孔)的孔中。將板在37℃下孵育30 min以進(jìn)行聚合。然后將SVEC細(xì)胞(血清饑餓過夜)接種到基質(zhì)膠層上，并使其與Opti-MEM在37℃下連接30 min。然后除去培養(yǎng)基并用QZD含藥血清或bFGF蛋白的Opti-MEM替換作為陽性對照。將細(xì)胞在37℃下孵育24 h。使用顯微鏡捕獲5個(gè)隨機(jī)選擇的視野。使用Image J軟件量化管長度和管覆蓋面積。

1.6 免疫熒光染色

將10T1/2細(xì)胞接入六孔板中，匯合度達(dá)到70%，在細(xì)胞中加入QZD含藥血清或bFGF作為陽性對照。用2%多聚甲醛固定10T1/2細(xì)胞。PBS洗3遍。用0.2%～0.5%triton X-100對細(xì)胞透化處理;PBS洗3遍。2%BSA封閉30 min，PBS洗兩遍。加入一抗α-SMA，室溫孵育1 h;加入二抗，室溫孵育30～45 min;PBS洗4遍，每次5 min。加入0.5 μg/mL DAPI(PBS配制)染色;用PBS洗3遍;加入20 μL封片劑封片。使用顯微鏡進(jìn)行觀察10T1/2狀態(tài)。

1.7 Western blot

將SVEC進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞中加入QZD含藥血清或bFGF作為陽性對照，經(jīng)過30 min后停止反應(yīng)，將SVEC細(xì)胞進(jìn)行裂解備用。分別制備SDS-PAGE分離膠和濃縮膠后，放入電泳的緩沖液。細(xì)胞裂解液與上樣緩沖液充分混勻，置沸水浴中加熱，冷卻后用微量移液器吸取樣品與預(yù)染蛋白并電泳。轉(zhuǎn)膜緩沖液中制作濾紙、凝膠、PVDF膜，350 mA轉(zhuǎn)膜。取出PVDF膜置于盛有脫脂奶粉的封閉液的平皿中，置于搖床上室溫封閉1 h。傾倒封閉液，加入一抗(p-ERK1/2和 p-p38按 1∶1000稀釋，β-actin按 1∶1000稀釋，Cell signaling technology公司，美國)，搖床上室溫振蕩孵育2～4 h，孵育過夜?；厥找豢梗肨BST洗滌5次。加入相應(yīng)鼠源二抗(1∶1000)。TBST洗滌3次，TBS洗滌1次。將發(fā)光顯色試劑盒材料混合后，加在膜上接觸反應(yīng)后，放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像分析。使用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 QZD含藥血清誘導(dǎo)SVEC細(xì)胞遷移

為了研究QZD含藥血清對內(nèi)皮細(xì)胞遷徙的生物學(xué)作用，使用SVEC細(xì)胞進(jìn)行劃痕遷徙試驗(yàn)進(jìn)行測定。結(jié)果提示，與PBS對照相比，加入QZD(100 ng/mL和200 ng/mL)對SVEC細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后可顯著增強(qiáng)SVEC細(xì)胞遷移(圖1)。bFGF(50 ng/mL)用作陽性對照。

圖1 QZD含藥血清誘導(dǎo)SVEC細(xì)胞遷徙 A:實(shí)驗(yàn)組(QZD)、陽性對照組［+bFGF(50 ng/mL)］較正常對照組均有促進(jìn)SVEC遷徙;B:細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)結(jié)果(*P＜0.05)。Fig．1 QZD-containing serum induces migration of SVEC cells．A:Test group(QZD)and positive control group［+bFGF(50 ng/mL)］promoted SVEC migration compared with normal control group;B:Counting result of cell migration experiment(*P＜0.05)．

2.2 QZD含藥血清誘導(dǎo)管腔結(jié)構(gòu)形成

為明確QZD含藥血清對SVEC形成血管結(jié)構(gòu)的作用，結(jié)果提示QZD含藥血清可刺激SVEC細(xì)胞中管狀結(jié)構(gòu)的形成(圖2A);與PBS對照相比，加入QZD的實(shí)驗(yàn)組管腔腔周長度(P＜0.05)和管腔面積(P＜0.01)顯著增強(qiáng)(圖2B、2C)。bFGF(50 ng/mL)用作陽性對照。

圖2 QZD含藥血清誘導(dǎo)管腔結(jié)果形成 A:實(shí)驗(yàn)組(QZD)、陽性對照組［+bFGF(50 ng/mL)］較正常對照組均有促進(jìn)SVEC管腔結(jié)構(gòu)形成;B:管腔面積計(jì)數(shù)結(jié)果(*P＜0.05，＊＊P＜0.01);C:管腔腔周長度計(jì)數(shù)結(jié)果(*P＜0.05)。Fig．2 QZD-containing serum induces lumen formation．A:Test group(QZD)and positive control Group［+bFGF(50 ng/mL)］promoted the formation of SVEC luminal structure compared with the normal control group;B:Counting result of tube area(*P＜0.05，＊＊P＜0.01);C:Counting results of cavity length(*P＜0.05)．

2.3 QZD含藥血清促進(jìn)10T1/2細(xì)胞聚集

為了明確QZD含藥血清對周細(xì)胞的作用，采用QZD對10T1/2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果提示，QZD可促進(jìn)10T1/2細(xì)胞聚集。與 PBS對照相比，加入QZD的實(shí)驗(yàn)組綠色熒光增強(qiáng)，細(xì)胞聚集，并呈管腔狀規(guī)律性排列(圖3)。bFGF(50 ng/mL)用作陽性對照。

圖3 QZD含藥血清誘導(dǎo)管腔結(jié)果形成。實(shí)驗(yàn)組(QZD)、陽性對照組［+bFGF(50 ng/mL)］較正常對照組均促進(jìn)10T1/2細(xì)胞的聚集、熒光表達(dá)增強(qiáng)和管腔狀有序性排列Fig．3 QZD containing serum induces lumen formation．Test group(QZD)and positive control Group［+bFGF(50 ng/mL)］promoted the aggregation and fluorescence expression of 10T1/2 cells compared with the normal control group．The lumens are arranged in an orderly manner．

2.4 QZD含藥血清經(jīng)MAPK/ERK通路介導(dǎo)SVEC分化

為了明確QZD含藥血清的作用機(jī)制，采用QZD對SVEC細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，在15 min后收集細(xì)胞并進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果提示，在加入QZD含藥血清后的 30 min時(shí)，pERK1/2(P＜0.01)和 p-p38(P＜0.05)的表達(dá)量較空白對照組高，但較陽性對照組弱(圖4)。bFGF(50 ng/mL)用作陽性對照。

圖4 QZD含藥血清經(jīng)MAPK/ERK通路介導(dǎo)SVEC分化 A:實(shí)驗(yàn)組(QZD)和陽性對照組［+bFGF(50 ng/mL)］的p-ERK1/2和p-p38的表達(dá)水平較空白對照組增高;B:p-ERK1/2與β-actin比值(＊＊P＜0.01);C:p-p38與β-actin比值(*P＜0.05，＊＊P＜0.01)。Fig．4 QZD containing serum mediates SVEC differentiation via MAPK/ERK pathway．A:Expression of p-ERK1/2 and pp38 in test group(QZD)and positive control group［+bFGF(50 ng/mL)］increased compared with normal control group;B:p-ERK1/2 and β-actin ratio(＊＊P＜0.01);C:p-p38 and β-actin ratio(*P＜0.05，＊＊P＜0.01)．

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞在骨代謝中血管重建具有重要作用，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，與周細(xì)胞結(jié)合并塑造血管的能力降低，骨代謝受到極大的限制，而恢復(fù)細(xì)胞活性目前仍受到藥物的限制［3，11］。中藥復(fù)方QZD是“祛痰逐瘀法”的代表方，由二陳湯和四物湯組合而成，在臨床上廣泛運(yùn)用于股骨頭壞死、創(chuàng)傷后骨不愈合等多種骨科疑難疾病。前期研究表明，QZD具有顯著促進(jìn)BMSCs的增殖及促成骨轉(zhuǎn)化能力，進(jìn)而驗(yàn)證了“祛痰逐瘀法”在預(yù)防激素性O(shè)NFH可能與調(diào)控BMSCs成骨分化有關(guān)［9-10］。然而，QZD在血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞分化，以及血管重建的作用知之甚少。

本研究表明，QZD含藥血清可以促進(jìn)SVEC的遷移，說明QZD含藥血清對于血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化具有重要的積極性。同時(shí)也間接說明了QZD促血管化的潛力可以運(yùn)用于骨修復(fù)及血管重建的。但是，血管重建的過程是復(fù)雜的。在多種血管激活物和促進(jìn)因子的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的聚集和組合，形成了血管的基本構(gòu)架［12］。周細(xì)胞毗鄰血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底部，通常以粘附或者連接的方式進(jìn)行接觸。特別是在逐漸成熟的新生血管中，周細(xì)胞從基底部向頂端遷徙和成熟，填補(bǔ)了血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的空隙，使血管趨于穩(wěn)定［13］。因此，在嘗試驗(yàn)證QZD含藥血清對于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管管腔形成作用的同時(shí)，更需要驗(yàn)證QZD含藥血清對于周細(xì)胞是否具有積極作用。

本研究表明，QZD含藥血清不僅可以促進(jìn)血管管腔形成、增大管腔的面積和腔面周長，同時(shí)還能增加周細(xì)胞的聚集。由此說明，QZD對于血管重建的作用具有多方面、立體化、復(fù)合性的特點(diǎn)。如上所述，血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的構(gòu)建關(guān)系影響血管化重建的效果。二者的協(xié)同作用對于需要修復(fù)的組織或器官是非常關(guān)鍵的步驟，在骨組織中同樣存在［14-15］。在不加干預(yù)的骨血管化重建治療期間，只有一小部分細(xì)胞能夠獲得有效的活性恢復(fù)和重構(gòu)［16］。在機(jī)能相對下降的慢性病患者或者老年性患者則更加緩慢，甚至導(dǎo)致進(jìn)一步的骨壞死擴(kuò)張和不愈合出現(xiàn)。因此，借助QZD提高多細(xì)胞的血管重構(gòu)和修復(fù)能力是合理的。

另外，QZD含藥血清干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)制也值得關(guān)注。目前，已報(bào)道多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移分化的調(diào)節(jié)有關(guān)［17-19］。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和P38絲裂原活化蛋白激酶(p38)在其中起關(guān)鍵作用，并參與增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［20-21］。在本研究中，QZD含藥血清處理30 min后，ERK 1/2和p38磷酸化水平顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明，對于QZD含藥血清所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移與分化，ERK 1/2和p38磷酸化的激活是必需的，這也是QZD促進(jìn)血管化的機(jī)制之一。

本研究使用劃痕遷徙實(shí)驗(yàn)和血管形成試驗(yàn)探究了QZD對SVEC分化的影響，以及對10T1/2對血管管腔成形的作用。結(jié)果提示，QZD可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔重建，且基于激活的ERK1/2和p38活化通路。盡管這一作用仍需要在活體中進(jìn)行論證，但是QZD卓越的促血管化重建能力為未來的中藥精準(zhǔn)化治療奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和微觀實(shí)證依據(jù)。