張旋 羅麗婭 王信 肖雪 王勇朋 陽琰 王哲 朱玉玉 樊思桐 李琪

1．遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州遵義563099

2．遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，貴州遵義563099

3．遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，貴州遵義563099

4．遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，貴州 遵義563099

近年來大量的流行病學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，25(OH)D與糖尿病及其并發(fā)癥等有關(guān)［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，25(OH)D具有保護胰島β細胞功能［4］、調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，改善骨代謝等作用［5］，且短期補充25(OH)D能改善胰島 β細胞功能［6］。骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨質(zhì)量受損及骨強度降低，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。根據(jù)《骨質(zhì)疏松癥防治中國白皮書》，我國至少有6 944萬人患有OP，2.1億人存在低骨量［7］。OP已成為我國第4位常見慢性疾病，T2DM人群中OP的發(fā)病率也明顯高于正常對照組［8］。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、OP 這兩種疾病均已成為世界上非常普遍的全身代謝性疾病，兩者往往好發(fā)于同一個體，并且兩者發(fā)病均與維生素D缺乏、脂代謝紊亂有關(guān)。25(OH)D缺乏不僅導(dǎo)致糖、脂代謝紊亂，還可以影響骨轉(zhuǎn)換、抑制骨吸收，最終導(dǎo)致 OP［9－10］。目前對于維生素 D 受體(vitamin D receptor，VDR)與糖尿病之間的關(guān)系研究較多，但是關(guān)于T2DM合并OP患者血漿中VDR mRNA表達與 25(OH)D、甘油三酯(triglyceride，TG)的關(guān)系如何，目前國內(nèi)外未見相關(guān)研究報道。因此，本研究從分子水平檢測外周血中VDR mRNA表達在T2DM合并骨質(zhì)疏松、單純T2DM及正常對照人群的差異性，探討外周血中VDR mRNA表達與25(OH)D、TG的關(guān)系，可能為T2DM、OP的防治提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年6月至2017年5月就診于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科門診及住院治療的初診T2DM患者100例，據(jù)骨密度測定結(jié)果分為單純T2DM組 48例［年齡(59.4±7.3)歲，男25例，女23例］、T2DM+OP組 52例［年齡(59.9±7.6)歲，男27例，女25例］;遵義醫(yī)科大學(xué)體檢中心年齡及性別相匹配的健康者90名［年齡(58.9±8.5)歲，男45例，女45例］作為對照組(NC組)。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。該研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn):①絕經(jīng)1年以上的女性及年齡≥60歲的男性;②18 kg/m2≤體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)≤25 kg/m2;③未接受過任何糖尿病治療措施，包括飲食、運動療法;④肝腎功能正常，無其他嚴重器質(zhì)性疾病及糖尿病急、慢性并發(fā)癥;⑤正常對照組無糖尿病及痛風(fēng)家族史;⑥無吸煙史及長期大量飲酒史。

排除標(biāo)準(zhǔn):①1型糖尿病或其他特殊類型糖尿病;②有高血壓病史、心腦血管疾病病史、骨折史、急慢性感染、惡性腫瘤病史，合并甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能低下、甲狀旁腺疾病、代謝性骨病等內(nèi)分泌疾病;③妊娠或哺乳期婦女或長期服用避孕藥的婦女;④近1個月內(nèi)使用過影響糖、脂代謝及其他影響體內(nèi)25(OH)D代謝的藥物。

1.2 研究方法

1.2.1 血漿25(OH)D及生化指標(biāo)的檢測:研究對象試驗前禁食12 h，禁飲8 h，空腹抽靜脈血，測血脂、血糖、胰島素。用電化學(xué)發(fā)光法測25(OH)D(試劑盒購于Roche Diagnostics GmbH)，試劑盒靈敏度為0.83 ng/mL，測量范圍為0.83～322.5 ng/mL，批內(nèi)差異為(7.6±3.5)%，批間差異為(6.7±2.0)%。FINS采用電化學(xué)發(fā)光法測定含量(試劑盒購于Roche Diagnostics GmbH)，血脂包括 TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)采用全自動生化儀統(tǒng)一檢測，F(xiàn)BG采用己糖激酶法，HbA1c水平采用高壓液相法測定。Real Time-PCR檢測VDR mRNA的表達。測血壓、身高、體重并計算BMI(kg/m2)，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖(FPG)×空腹胰島素(FINS)/22.5。

1.2.2 RNA的提取和DNA的合成:所有研究對象采集5 mL外周靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝。采用淋巴細胞分離液從外周血中分離淋巴細胞，然后用Trizol法提取總RNA。紫外分光光度計檢測RNA在260 nm/280 nm波長處的吸光度值，A260/A280在1.9～2.1純度符合要求。總mRNA提取試劑盒及第一條鏈合成試劑盒由Promega公司提供;Real time PCR熒光定量試劑盒由Promega公司提供。根據(jù)試劑盒說明進行操作。

1.2.3 Real time PCR熒光定量反應(yīng)體系及過程:提取血漿中總RNA，以總RNA 1.5μg為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板，進行逆轉(zhuǎn)錄總的反應(yīng)體積是20 μL。VDR引物正義:5’CAGGCTATCATTACGGAGTC 3’;反義:5’CTGGCATTTGTTTCTGTTCT 3’;β-acti引物正義:5’TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG 3’;反義:5’TGCTGTCACCTTCACCGTTC 3’。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃～72℃退火30 s，75℃延伸1 min，循環(huán)28～31次，72℃終末延伸5 min。退火溫度和循環(huán)次數(shù)VDR 56℃，30個循環(huán);β-actin 57℃，28個循環(huán)。為了校正誤差，本研究利用管家基因β-actin作為內(nèi)參，以待測樣品目的基因的拷貝數(shù)平均值除以該樣品內(nèi)參基因的拷貝數(shù)平均值，得到目的基因的相對含量。樣品中模板的拷貝數(shù)可由SDS軟件通過所得到的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算得到。

1.2.4 設(shè)計合成引物:通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Gene數(shù)據(jù)庫，查找人各目的基因的mRNA核苷酸序列及序列號，然后用Primer-BLAST比對引物特異性，由TaKaRa公司合成。各引物的序列見表1。

表1 各基因引物序列(熒光定量PCR測定)Table 1 Specific primers used for Real-time PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，計量資料為正態(tài)分布采用兩組獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布則采用非參數(shù)秩和檢驗，計數(shù)資料則用卡方檢驗。采用Pearson相關(guān)分析VDR mRNA表達與25(OH)D、血糖等指標(biāo)的關(guān)系，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料及臨床生化指標(biāo)的比較

單純T2DM組與NC組相比，血漿25(OH)D水平減低，而 TG、FPG、2h PG、HbA1c、FINS、HOMA-IR水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);T2DM+OP組與NC組相比，血漿25(OH)D水平減低，而TG、FPG、2h PG、HbA1c、FINS、HOMA-IR 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);T2DM+OP組與單純T2DM組相比，血漿中25(OH)D水平減低，而TG水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.232，P＜0.05)，F(xiàn)PG、2h PG、HbA1c、TC、FINS、HOMA-IR 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);三組間年齡、血壓、TC、HDL-C、LDL-C相互比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 各組一般資料及臨床生化指標(biāo)比較(珋x±s)Table 2Comparison of general characteristics and biochemical indicators among the groups(珋x±s)

續(xù)表2各組一般資料及臨床生化指標(biāo)比較(珋x±s)Continued table 2Comparison of general characteristics and biochemical indicators among the groups(珋x±s)

2.2 Real time PCR檢測VDR mRNA的表達

單純T2DM組與NC組相比，外周血中VDR mRNA表達水平減低(1.07±0.23 vs 2.98±0.21)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=21.256，P＜0.05);T2DM+OP組與NC組相比，外周血中VDR mRNA表達水平減低(0.35±0.12 vs 2.98±0.21)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=23.522，P＜0.05);T2DM+OP組與單純 T2DM組相比，外周血中 VDR mRNA表達水平減低(0.35±0.12 vs 1.07±0.23)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.232，P＜0.05)(圖1)。

圖1 三組受試者血清25(OH)D水平的比較Fig．1 Comparison of serum 25(OH)D levels between three groups of subjects

2.3 Pearson相關(guān)分析結(jié)果

血漿25(OH)D 與性別、年齡、血壓、BMI、TC、HDL-C、LDL-C的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與 HbAlc、HOMA-IR、FINS、FPG、2h PG、TG 呈負相關(guān)(相關(guān)系數(shù) r分別為－0.342、－0.353、－0.361、－0.546、－0.426、－0.342，P＜0.05);與 VDR mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.717，P＜0.05)。詳見表3。

表3 血漿中25(OH)D水平與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of plasma 25(OH)D levels and clinical biochemical indicators

3 討論

維生素D的生物學(xué)作用已經(jīng)超出傳統(tǒng)范疇，與心血管疾病、代謝綜合征、腫瘤和免疫應(yīng)答等均有關(guān)［11－12］。維生素D與糖尿病的關(guān)系已成為研究熱點，維生素D缺乏者不僅與骨質(zhì)疏松有關(guān)，更易患代謝綜合征及糖尿病［13］，糖尿病患者中普遍存在維生素D水平的缺乏［14］。血清中25(OH)D與脂肪組織維生素D受體基因表達有關(guān)，并且與糖代謝有關(guān)［15］。T2DM、脂代謝紊亂及 OP，它們看似獨立的疾病，但它們?nèi)咄⒋嬗谕粋€體，使患者生活質(zhì)量更趨下降，加重了家庭及社會的經(jīng)濟負擔(dān)，已成為全球共同關(guān)注的健康問題。長期以來，研究T2DM發(fā)病機制時首先考慮的是血糖和胰腺，但迄今為止，T2DM發(fā)病機制研究一直未取得突破性進展。最新研究發(fā)現(xiàn)，血清中維生素D缺乏不僅導(dǎo)致OP，還可能導(dǎo)致糖、脂代謝紊亂，它們?nèi)咧g關(guān)系緊密，但它們之間具體的關(guān)聯(lián)機制如何，尚未闡明。目前國內(nèi)外未見2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松患者血漿中VDR mRNA表達與25(OH)D、甘油三酯關(guān)系方面的相關(guān)研究報道。因此，從維生素D入手對這一問題進行探索，不僅對闡明T2DM發(fā)病機制具有重要作用，還可能對臨床早期聯(lián)合防治糖尿病、脂代謝紊亂及OP具有深遠的意義。

本研究結(jié)果示，T2DM+OP組與單純T2DM組相比，血漿中25(OH)D水平減低，而TG水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);單純T2DM組與NC組相比，血漿中VDR mRNA表達水平減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);T2DM+OP組與NC組相比，血漿中VDR mRNA表達水平減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);T2DM+OP組與單純T2DM組相比，血漿中VDR mRNA表達水平減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。導(dǎo)致 T2DM合并 OP人群外周血中VDR mRNA表達水平較單純T2DM及正常人群減低的原因與T2DM合并OP人群血漿25(OH)D水平更低有關(guān)，推測T2DM合并OP更容易患維生素D缺乏及脂代謝紊亂，維生素D缺乏及脂代謝紊亂可能通過下調(diào)外周血中VDR mRNA表達而導(dǎo)致糖尿病及OP的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果還顯示，血漿中25(OH)D水平與HOMA-IR、TG呈負相關(guān)，25(OH)D缺乏可能通過降低機體對胰島素的敏感性，加重胰島素抵抗，導(dǎo)致脂代謝紊亂，引起甘油三酯水平升高。研究發(fā)現(xiàn)，維生素D有降脂作用，且25(OH)D與TG、LDL、TC之間存在線性負相關(guān)［16］。維生素D的生物效應(yīng)是由維生素D受體介導(dǎo)的［17］，維生素D可以通過調(diào)節(jié)胰島β細胞內(nèi)的VDR以及胰腺組織中維生素D依賴性鈣結(jié)合蛋白促進β細胞合成和分泌胰島素，減輕IR［18］。提示VDR及25(OH)D參與了糖尿病、OP的發(fā)生發(fā)展，維生素D缺乏影響糖尿病、OP發(fā)病的可能機制是:體內(nèi)維生素D減低，使外周血中VDR mRNA表達減少，維生素復(fù)合物形成減少，減少維生素D的生物學(xué)效應(yīng)，從而引起脂代謝及骨代謝紊亂，形成高甘油三酯血癥、骨量減少，加重胰島素抵抗，促使糖尿病、OP發(fā)病率增高;反過來，糖尿病合并OP后血漿中25(OH)D水平減低，加重高甘油三酯血癥、骨量丟失及胰島素抵抗，這就形成了一個惡性循環(huán)。因此，積極補充維生素D可能會打破這一惡性循環(huán)，降低TG水平，減少骨量丟失，從而改善IR及骨代謝，可能對T2DM、OP的聯(lián)合防治具有非常重要的作用，但其具體機制有待進一步研究探索。