賈慶運(yùn) 王擁軍 梁倩倩 施杞*

1．上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032

2．上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海200032

3．山東省日照市中醫(yī)醫(yī)院，山東日照276800

4．筋骨理論與治法教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200120

5．上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，上海200120

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以對(duì)稱(chēng)性多關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的慢性、進(jìn)行性、系統(tǒng)性自身免疫疾?。?］。RA的主要病理特征為滑膜細(xì)胞的增生、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，血管翳形成以及由此引發(fā)的關(guān)節(jié)軟骨、骨的破壞，因此，控制RA滑膜細(xì)胞炎癥因子及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)分泌是治療 RA的關(guān)鍵［2-3］。槲皮素(quercetin)是一種廣泛存在于自然界的黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、清除氧自由基以及免疫調(diào)節(jié)等活性。臨床研究表明，槲皮素對(duì)緩解膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)、運(yùn)動(dòng)后機(jī)體疼痛具有良好的作用［4-8］。因此，本研究通過(guò)觀察槲皮素對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的影響，探討槲皮素治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(MH7A)由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院張鵬研究員課題組所贈(zèng)與，細(xì)胞來(lái)源日本理化研究所細(xì)胞 (Tsukuba，Japan)。

1.1.2 試劑及藥物:槲皮素購(gòu)成都普菲德生物技術(shù)有限公司(純度＞98%)，1640培養(yǎng)基(HyClone)，胎牛血清 (fetal bovineserum，F(xiàn)BS)(Gibco)，TNF-α(Pepro TECH)，CCK-8試劑盒(Dojindo)，PCR 引物(華大基因)，RNA提取試劑盒(Qiagen)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)，電泳液、轉(zhuǎn)膜液(碧云天)。

1.1.3 儀器:超凈臺(tái)、熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱、顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):MH7A細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d傳代，實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法:(1)CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞毒性。CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性，MH7A細(xì)胞按照4×104密度接種于96孔板，不同濃度的槲皮素處理細(xì)胞 0、24、48、72 h，每孔加入 10 μL 的 CCK-8試劑，將 96孔板放置于 37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，酶標(biāo)儀450 nm、630 nm處測(cè)定其吸光度。(2)RT-PCR法檢測(cè)炎癥因子。將MH7A細(xì)胞系以1×106密度接種于含有2 mL的1640完全培養(yǎng)基的6孔板中，將6孔板放置于37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，50、100 nmol/L的槲皮素預(yù)處理MH7A細(xì)胞2 h，加入 TNF-α(10 ng/mL)刺激 MH7A細(xì)胞24 h，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，Takara試劑盒反轉(zhuǎn)成 cDNA，RT-PCR 法檢測(cè) IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達(dá)。引物序列見(jiàn)表 1。(3)Western blot法檢測(cè)對(duì)NF-κB的影響。將MH7A細(xì)胞系以1×106密度接種于含有2 mL的1640完全培養(yǎng)基的6孔板中，將6孔板放置于37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，50、100 nmol/L的槲皮素預(yù)處理MH7A細(xì)胞2 h，加入TNF-α(10 ng/mL)刺激MH7A細(xì)胞30 min，細(xì)胞蛋白裂解液(RIPA)提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白含量，10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉2 h，加入一抗室溫孵育2 h，洗膜15 min，二抗室溫孵育1.5 h，洗膜15 min，HRP化學(xué)發(fā)光顯色、拍照。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)MH7A細(xì)胞毒性的影響

用含槲皮素濃度分別為 0、25、50、100、200、400 μmol/L、0.2%DMSO的 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)MH7A細(xì)胞24、48、72 h后，用CCK-8法測(cè)定其對(duì)細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果顯示(圖1)，槲皮素濃度為100 μmol/L以下時(shí)，實(shí)驗(yàn)組之間以及跟DMSO組相比，無(wú)明顯細(xì)胞毒性。因此，筆者認(rèn)為槲皮素在100 μmol/L以下時(shí)，對(duì)MH7A細(xì)胞系無(wú)顯著細(xì)胞毒性作用。

圖1 槲皮素對(duì)MH7A細(xì)胞毒性的影響Fig．1 Effect of quercetin on cytotoxicity of MH7A

2.2 槲皮素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞炎癥因子及MMPs的影響

MH7A 細(xì)胞系在經(jīng)過(guò)(50、100 μmol/L)槲皮素預(yù)處理2 h后，使用10 ng/mL的TNF-α進(jìn)行刺激24 h，提取細(xì)胞RNA，用RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)炎癥因子及MMPs的變化。結(jié)果顯示(圖2)，槲皮素能夠顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8 和 MMP-1、MMP-3、MMP-13 表達(dá)，并呈劑量依賴(lài)的特點(diǎn)。

圖2 槲皮素對(duì)MH7A細(xì)胞炎癥因子及MMPs的影響Fig．2 Effects of quercetin on inflammatory factors and MMPs in MH7A cells

2.3 槲皮素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞NF-κB的影響

MH7A 細(xì)胞系在經(jīng)過(guò)(50、100 μmol/L)槲皮素預(yù)處理2 h后，使用10 ng/mL的TNF-α進(jìn)行刺激30 min，提取細(xì)胞總蛋白，用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)磷酸化NF-κB p65的變化。結(jié)果顯示(圖3)，槲皮素能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞 NF-κB p65磷酸化表達(dá)，并呈劑量依賴(lài)的特點(diǎn)。

圖3 槲皮素對(duì)MH7A細(xì)胞NF-κB p65磷酸化的影響Fig．3 Effect of quercetin on phosphorylation of NF-kappa B p65 in MH7A cells

3 討論

槲皮素是人類(lèi)飲食中最主要的生物類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中［9-10］。槲皮素具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用［11-13］，相關(guān)研究表明槲皮素可有效減輕免疫細(xì)胞炎癥因子的分泌的作用［14］，這種抑制作用可能和槲皮素因抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的生物活性相關(guān)［15］。相關(guān)臨床研究表明，槲皮素對(duì)疼痛類(lèi)疾病的緩解具有良好的作用，對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疼痛的緩解同樣效果良好［5-6，16-23］。

滑膜細(xì)胞在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色［2］?；ぜ?xì)胞可釋放多種炎癥因子［24-25］(IL-1β、IL-6、IL-8)，在 RA 的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，因此抑制滑膜細(xì)胞的炎癥因子釋放，可對(duì)RA的起到治療作用。MMPs是可降解細(xì)胞外基質(zhì)的鋅依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶，MMPs可降解關(guān)節(jié)骨與軟骨中的膠原、蛋白多糖及其他的機(jī)制大分子，促進(jìn)血管翳對(duì)軟骨的侵襲?；ぜ?xì)胞來(lái)源的MMPs是導(dǎo)致關(guān)節(jié)病理?yè)p傷的重要因素之一［26-27］，因此，抑制 MMPs的產(chǎn)生，可有效減輕RA關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨破壞，延緩骨質(zhì)破壞的進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可有效降低TNF-α 誘導(dǎo)的 MH7A 細(xì)胞炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-8和 MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達(dá)，同時(shí)槲皮素可有效降低TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞NF-κB p65磷酸化表達(dá)，因此，推斷槲皮素抑制MH7A細(xì)胞炎癥因子和MMPs的表達(dá)可能和抑制NF-κB p65磷酸化表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，槲皮素可有效抑制TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞炎癥因子、MMPs的表達(dá)和NF-κB p65磷酸化，槲皮素是治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在有效藥物。