屈政委，宋紅梅，汪學杰，劉 奕，牟希東，劉 超，胡隱昌

(1.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業(yè)農村部休閑漁業(yè)重點實驗室，廣東省現代休閑漁業(yè)工程技術研究中心，廣州 510380；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

印尼虎魚，又名印尼擬松鯛(DatnioidesPulcher)，隸屬鱸形目(Perciformes)鱸亞目(Percoidei)松鯛科(Lobotidae)擬松鯛屬(Datnioides)，俗稱印尼虎魚，主要分布于湄南河流域、湄公河流域以及印尼蘇門答臘的婆羅洲西部，是當地一種非常珍稀的物種。印尼虎魚因其紋路深邃，對比分明，身板寬厚有力，捕食間隙展示了它的力量之美，因而備受人們喜愛，本世紀初作為觀賞魚引入我國，常與龍魚同池養(yǎng)殖，寓意“龍爭虎斗”。然而虎魚價格一直居高不下，關于其遺傳背景、遺傳結構等基礎生物學等研究嚴重匱乏，虎魚存在雌雄難以辨別、雌雄發(fā)育成熟時期不一致等特點，在國內也尚未有人工繁殖成功的報道，在雌雄鑒別、親本鑒定和遺傳結構等方面資料甚少，僅有線粒體數據分析[1]，急需填補相關基礎研究數據。

簡單重復序列(simple sequence repeats,SSR)又稱微衛(wèi)星序列，是由長度為1～6 bp的重復單元和側翼序列組成的DNA序列串，而根據其開發(fā)的DNA分子標記具有共顯性、重復性好、穩(wěn)定性高、操作簡單、遍布整個基因組等特點。自20世紀70年代發(fā)展起來，已被廣泛應用到動植物的遺傳研究中，隨著更多物種轉錄組等基因組數據的獲得，SSR標記應用于布什羅非魚(Tilapiabuttikoferi)[2]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[3]、鯽(Carassiusauratus)[4]等水產動物的遺傳圖譜、遺傳多樣性、遺傳進化、親緣關系分析等方面研究也多有報道。近年來，依據磁珠富集法及EST及數據開發(fā)和挖掘SSR標記的方法廣泛被采用，如孔杰等采用磁珠富集法開發(fā)長臀鮠(Cranoglanisbouderius)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標記27對[5]，曹柱等采用磁珠富集法開發(fā)方正銀鯽(C.auratusgibelio(Bloch))具有多態(tài)性位點的微衛(wèi)星標記30對，并進行群體驗證[6]。此后，利用轉錄組數據庫開發(fā)微衛(wèi)星標記的方法也在動植物中被大量報道，如銀鲴(Xenocyprisargentea)[7]、紅鯛(Lutjanuscampechanus)[8]、鮸(Miichthysmiiuy)[9]、烏鱧(Channaargus)[10]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[11]、馬氏珠母貝[12]、臘梅(Chimonanthuspraecox)[13]等的SSR標記開發(fā)。然而轉錄組相對成本較高，目前，印尼虎魚尚未獲得全基因組或轉錄組數據，甚至也沒有擬松鯛科近源物種的可參考全基因組序列。

近年來，在第2代測序基礎上發(fā)展而來的RAD測序技術(Restriction-site-associated DNA sequencing)應運而生，利用限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，并對酶切片段進行高通量測序，所實現的簡化基因組測序技術被逐步運用。簡化基因組測序技術極大的降低基因組的復雜度，且不受參考基因組的限制，無參考基因組的物種也可以使用該技術進行大量的 SNP 和 SSR 標記開發(fā)，測序成本也顯著降低、準確率高[14-15]。采用此方法，已經在煙草[16]、大刺鰍[17]、異型花[18]等其他動植物中開發(fā)出 SSR 標記并應用于遺傳研究。本研究采用RAD-seq技術，對印尼虎魚進行簡化基因組測序，分析SSR位點的數量、基序類型、基序重復次數，開發(fā)印尼虎魚微衛(wèi)星標記，篩選具有多態(tài)性的SSR引物，為印尼虎魚擬松鯛魚類多態(tài)性SSR的篩選和遺傳研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗群體和基因組DNA的提取

試驗魚取自廣州珠江水產研究所觀賞魚基地，試驗魚三尾，采樣后取鰭條在4 ℃冰箱中放置，過夜后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用試劑?TIANamp Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取基因組DNA。

提取過程：每尾魚取約0.03 g組織，加400 μL裂解液，用勻漿機將樣品充分研磨。室溫10 000 r/min離心1 min,倒掉上清液，加200 μL緩沖液GA，震蕩至徹底懸浮。隨后再加20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混勻后55 ℃恒溫水浴，水浴過程中上下顛倒加速溶解，至組織消解完全，簡短離心。加200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 ℃水浴10 min，混合液變得清亮后，簡短離心。加200 μL無水乙醇，充分震蕩15 s，簡短離心。將混合液轉移至吸附柱中，室溫12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。向吸附柱中加500 μL緩沖液GD，室溫12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。向吸附柱中加600 μL漂洗液PW，室溫12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。12 000 r/min離心2 min,倒掉廢液，室溫下晾干至無乙醇味。將吸附柱放在新的離心管中，加30 μL雙蒸水靜置數分鐘充分溶解，12 000 r/min離心2 min，將DNA收集到離心管中。所提取的模板DNA經瓊脂糖凝膠定性檢測，再用酶標儀定量檢測，經檢測OD260/OD280的比值以及模板DNA濃度符合作為模板DNA的條件，保存在-20 ℃中備用。

1.2 簡化基因組測序

利用RAD-seq測序技術，對印尼虎魚的基因組DNA進行簡化測序。簡易流程如下：采用6堿基酶EcoRI進行RAD酶切建庫，Paired-End100策略上機(Illumina HiSeq2000)進行高通量測序，測序所得數據進行RAD tag(標簽)的聚類，產生組裝apire-end read(read 2)，通過contig檢測和組裝得到長度約300 bp的酶切相關contig，用以開發(fā)SSR標記。

1.3 基因組SSR位點的篩選和引物設計

利用MISA軟件(MicroSatellite identification tool，http://pgrc.ikp- gatersleben.de/misa)在read 2覆蓋的參考基因組序列中進行SSR位點搜索，搜索標準為單堿基、二堿基和三堿基重復次數分別在15、6和5次及以上，四、五、六堿基重復類型在4次及以上，相鄰的SSR序列不少于100 bp。根據SSR位點兩翼序列，利用Primer3.0軟件設計引物，數據庫中隨機選取100對微衛(wèi)星引物，由廣州擎科生物技術公司合成。對虎魚基因組DNA樣品(6個樣品)進行序列分析，若在測序個體間存在重復差異即為多態(tài)性SSR。

1.4 PCR擴增和產物檢測

PCR反應為25 μL體系：酶0.25 μL,10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，4×dNTP 0.5 μL，10 μmol/L上游引物0.5 μL，10 μmol/L下游引物0.5 μL，模板cDNA 0.5 μL，加無菌水補足至25 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s(退火溫度視情況而定)，72 ℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,然后再通過銀染得到目的條帶。

2 結果與分析

2.1 印尼虎魚簡化基因組序列產出的檢測

印尼虎魚RAD-seq結果顯示，數據庫中獲得總長度為1.96 Gb，具有13 427 412個干凈讀長(clean reads)的原始數據(表1)，對原始數據進行質量控制、過濾，共獲得13 308 806個高質量干凈讀長(HQ clean reads)，平均Q30(測序堿基質量值，即測序時錯誤識別的概率為0.1%、正確率為99.9%的堿基比例)為93.31%，平均的GC含量為42.72%。從表1得知，過濾前后差異不大，Q30處于較高水平，表明測序數據的準確可靠性，GC含量稍低，但對此次測序反應的影響不大。

表1 RAD-seq 基因組測序數據統計表

2.2 印尼虎魚簡化基因組中的SSR位點頻率和分布特征

此次RAD-seq獲得的干凈讀長(clean reads)進行簡化基因組組裝，read2拼接所得平均長度333 bp大小的片段163 510個，利用MISA軟件在reads覆蓋區(qū)域中查找SSR位點，在樣本中共有21 259個reads含有SSR位點，共檢測到26 359個SSR位點， SSR位點出現頻率(含SSR位點個數與read2的contig總個數的比值)為16.1%。這些SSR位點中，完全重復型(P型)所占比例最大，共計20 616個，占位點總數的78.21%；復合型(C型)只有3 105個，占位點總數的11.78%。

26 359個微衛(wèi)星位點由496種重復基序組成(表2)，主要分布在三、四、五堿基重復類型中,分別有57、173和199種，占基元總數比為11.49%、34.88%和40.12%。而單核苷酸重復位點的基元種數共4種(即ATCG四種堿基)，六核苷酸重復基元種數為51種，所占基元總數比例為10.28%。

2.3 SSR的位點基序重復次數與序列類型

印尼虎魚不同類型SSR位點中單核苷酸基元的重復次數集中在15～20次，二核苷酸和三核苷酸基元主要集中在6～13次和5～9次，四核苷酸基元在4～6次，而五核苷酸和六核苷酸基元的重復次數4～5次；以6次基元重復次數的SSR位點數最高，達到5 214個SSR位點，占總SSR位點數19.78%；7次和8次重復次數分別為3 076和2 176個SSR位點，占總SSR位點數11.67%和8.26%。另外，隨重復次數的增加各個位點類型出現的頻率逐漸下降。通過分析所得到的SSR數目的具體結果列入表3。

表2 印尼虎魚基因組-微衛(wèi)星位點的分布信息

表3 印尼虎魚基因組中 SSR 位點的基序重復次數分布

如表3所示，SSR位點中二核苷酸類型出現比例最高，達19 492個，占位點總數的73.95%；其次是單核苷酸類型和三核苷酸類型差別不大，分別為2 209(8.38%)和2 271個(8.62%)；四核苷酸類型為1 847個(7.01%)；五核苷酸和六核苷酸類型最少，分別僅有479(1.82%)和61個(0.23%)。此外，有3 105個位點以復合重復形式出現,多態(tài)性SSR數目為2 783個。

圖1 基元類型比例圖Fig.1 Primitive type scale

在SSR重復序列中，二堿基重復序列所占比最大，主要有AC/GT、AG/CT、AT/AT三種重復序列，其中AC/GT重復序列16 040個，占比最高為總數的60.9%，其次為AG/CT重復序列3 027個,占11.5%，最后是AT/AT重復序列374個，所占比例為1.4%；其次是單堿基重復序列，主要有A/T、C/G兩種重復類型，其中A/T重復序列1 998個，所占比例較大，比例為7.6%，C/G重復序列211個，占比為0.8%。三堿基重復序列包含6種重復類型，分別為AAC/GTT、AAG/CTT、AAT/ATG、AGC/CTG、AGG/CCT、ATC/ATG，各個序列的數目分別為339、364、348、381、468、179，所占比例分別為1.3%、1.0%、1.3%、1.4%、1.8%、0.7%；四堿基重復序列包括4種重復類型，分別為AAAC/GTTT、AAAT/ATTT、ACAG/CTGT、AGAT/ATCT，每個重復序列的數目分別為344、305、215、211，所占比例分別為1.3%、1.2%、0.8%、0.8%；五堿基重復序列和六堿基重復序列共有1 665個，占序列總數目的6.3%。除二堿基重復類型外，A/T重復序列占比7.6%最大，其他類型的基元占比相差無幾，大部分在1%左右。各基元頻率分布見圖1。

2.4 多態(tài)性SSRs標記的序列信息

利用Primer 3.0軟件對26 359個SSR位點進行引物設計，成功設計出20 066對SSR引物，引物設計成功率為76.13%；根據印尼虎魚簡化測序數據，初步發(fā)現其中有2 783對引物的SSR位點具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為13.9%。隨機選擇100對可能具有多態(tài)性位點的SSR引物，對SSR位點的多態(tài)性進行驗證。有92對引物在檢測樣品中均能擴出清晰的條帶，其中有 20對引物的擴增產物具有多態(tài)性。具有多態(tài)性的20對SSR引物信息及驗證結果如表 4 所示。

表4 20對多態(tài)性SSRs引物信息

3 討論

本研究在21 259個reads覆蓋的參考基因組序列中共檢測到完全重復型(P型)和復合型(C型)兩種SSR位點共計26 359個，其中P型20 616個，所占比例最大(78.21%)，C型只有3 105個，占位點總數的11.79%。在所有SSR位點中二核苷酸類型出現比例最高，達73.95%，這與其他動植物基因組中SSR位點的分布特征相符[16,19,20]，其他物種中大多數都是二堿基重復類型占據主體地位，但二堿基比例如此高的并不多見。如對牙鲆(Paralichthysolivaceus)EST資源的SSR信息分析中，二堿基重復類型所占比例為59.02%[21]。從目前報道的結果來看,馬氏珠母貝的EST-SSR也是以二核苷酸重復類型為主(48.5%)[12]，而在縊蟶(Sinonovaculaconstricta)EST-SSR分布特征及引物開發(fā)利用研究中卻是以三核苷酸重復類型為主(37.13%)[22]。這種現象可能是因為密碼子以三核苷酸為功能單位,在翻譯成蛋白質時發(fā)生基因突變而造成三核苷酸的位移,但沒有對一個表達基因的閱讀框造成太大的影響[23]。

在SSR 位點重復類型上，本研究中印尼虎魚的二核苷酸類型出現比例最高，這與多數物種中以二核苷酸重復類型為主的結果一致[21]；在SSR基序的結構方面，共發(fā)現496種基序，各核苷酸類型中以A/T、AC/GT、AG/CT、AGG/CCT 、AGC/CTG、AAAC/GTTT基序最為豐富，這與烏鱧、斑鱧、鳙魚等SSR位點特征相似[10,24]，在重復類型分布上，單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸均表現出一定的偏倚性，如單核苷酸重復類型中A/T重復序列1 998個，而C/G重復序列只有211個，在二核苷酸重復類型中AC/GT占主要優(yōu)勢，三堿基重復類型中最多的是AGG/CCT，二、三核苷酸重復類型在不同物種間差異較大[6,17]，這種重復單元的偏倚性和重復類型的差異與種間差異性有關[5,22]。

SSR位點的多態(tài)性與重復基元的重復次數呈正相關關系[25]。本研究中獲得的SSR位點中，單核苷酸基元類型重復次數集中在15～20次，二核苷酸和三核苷酸基元主要集中在5～13次，隨重復次數的增加各個位點類型出現的頻率逐漸下降。為找到具有多態(tài)性的位點，本研究挑選的基元類型中，二核苷酸類型重復次數≥6、三核苷酸重復次數≥5、四核苷酸重復次數≥4，錦鯉選取重復單元次數較高的序列進行篩選。挑出100對SSR引物，以6個印尼虎魚樣本基因組DNA為模板進行檢測驗證，其中肯定能擴增出目的片段的引物有73對，剩余27對未擴增出條帶或擴增出非目的片段。73對有效擴增的引物中有20對具有多態(tài)性，初步開發(fā)的20個具有多態(tài)性的SSR位點，可用于擬松鯛魚類的群體遺傳背景分析，同時本研究也證實了通過RAD-seq技術開發(fā)印尼虎魚SSR標記的可行性。

4 結論

本研究采用RAD-seq首次對印尼虎魚樣本進行了測序，共獲得13 308 806個高質量干凈讀長(HQ clean reads)，通過序列分析，在21 259個reads覆蓋的參考基因組序列中共檢測到26 359個SSR位點，主要以單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復類型為主。從中隨機選二、三、四核苷酸重復類型微衛(wèi)星位點100個，合成引物進行PCR擴增驗證，可穩(wěn)定擴增出目的條帶的有73對，其中20對具有多態(tài)性。