普布卓瑪， 羅藝嵐， 高金柱， 孫鵬越， 趙東豪，苗彥軍， 付娟娟*， 呼天明*

(1.西北農林科技大學草業(yè)與草原學院， 陜西 楊凌 712100； 2. 西藏自治區(qū)農科院草業(yè)科學研究所， 西藏 拉薩 850000；3. 西藏農牧學院植物科學學院， 西藏 林芝 860000)

青藏高原是世界上隆起最晚、面積最大、海拔最高的高原，因而被稱為“世界屋脊”，被視為南極、北極之外的“地球第三級”。西藏高原位于青藏高原的主體區(qū)域。平均海拔4 000 m以上，由于地形、地貌和大氣環(huán)流的影響，氣候獨特而且復雜多樣。研究優(yōu)良牧草的抗寒性具有非常重要的價值。垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb.)是我國青藏高原重要的優(yōu)質牧草，其營養(yǎng)價值高、分蘗能力強、再生性好、根系發(fā)達是一種抗逆性很強的牧草。在畜牧業(yè)生產發(fā)展與生態(tài)環(huán)境保護等方面發(fā)揮重要的作用[1-4]。

低溫作為重要的非生物逆境，會嚴重影響植物的生長發(fā)育以及地理分布，還會對植物造成多方面的損傷，包括生物膜透性增大、活性氧積累引起氧化損傷等，嚴重時會造成植物的死亡[5-6]。油菜素內酯(Brassinolide,BRs)是一種新型植物內源激素，由于其生理活性大大超過現有的5種激素，已被國際上譽為第六大類激素。研究發(fā)現，BRs不僅能夠調節(jié)植物的生長發(fā)育，還能夠提高植物對低溫等多種抗性。BRs可以誘導多種抗氧化酶如抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)和谷胱甘肽過氧化物酶(Guaiacol peroxidase,GPX)等酶活性增加，增強植物的抗氧化能力，減少膜脂過氧化作用，從而提高植物的低溫抗逆性[7]。然而，目前對于BRs調控垂穗披堿草的低溫適應機理尚不明晰。

本研究擬以西藏野生垂穗披堿草為研究對象，采用葉面積噴施外源BRs的方法，探究BRs調控西藏野生垂穗披堿草低溫適應的生理機制，旨在為BRs調控植物的低溫適應性提供新理論。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本供試材料為野生垂穗披堿草采集于西藏拉薩市當雄縣(30°28.535′ N，91°06.246′ E，海拔4 618 m)，由西藏大學農牧學院提供。

1.2 試驗設計

種子經0.1%(W/V)次氯酸鈉溶液消毒，用蒸餾水沖洗數次后，放置于鋪有濕潤的培養(yǎng)皿中，置于人工氣候箱中萌發(fā)。待幼苗長至2 cm左右時，選取健康植株轉移至培養(yǎng)缽中，采用沙培的方式在人工氣候箱中(光通量密度350 μmol·m-2· s-1，光照14 h，25℃，濕度80%；暗期10 h，25℃，濕度60%)進行幼苗培養(yǎng)，期間幼苗每3 d更換一次Hoagland營養(yǎng)液。將預培養(yǎng)21 d的幼苗進行處理，初步設置5個不同濃度梯度(0,0.001,0.01,0.1,1 μmol·L-1)來篩選2,4-表油菜素內酯(EBR)的最佳作用濃度。確定EBR最佳作用濃度后，試驗設4個處理：CK (25℃,Hoagland營養(yǎng)液)，低溫處理(4℃,Hoagland營養(yǎng)液)，CK+EBR處理(25℃,EBR)，低溫+EBR (4℃,EBR)，每處理3次重復，用1 μmol·L-1外源EBR處理釆用葉面噴施的方法，早晚各1次，以葉面剛好打濕為標準(不下滴液體)。低溫(4℃)處理5 d后，采集低溫處理的樣品。

1.3 指標測定

1.4 數據分析

所有數據均用MicrosoftExcel 2003 錄入并作圖，采用SPSS 19.0軟件對數據進行One-way ANOVA進行單因素方差分析，采用Duncan ' s法對平均值進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同濃度EBR處理對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗生長、表型和細胞膜損傷的影響

低溫處理顯著降低了垂穗披堿草幼苗的鮮重，噴施外源EBR能提高幼苗的鮮重。如圖1可知，與CK相比，低溫處理后幼苗的生長受到抑制，幼苗鮮重顯著降低了63.20%(P< 0.05)。T1，T2，T3，T4處理和低溫處理相比，分別增加了13.04%，36.96%，28.26%，95.65%，其中在T4的處理效果最好(圖b)。電導率可表示質膜透性和質膜受傷害的程度。與CK相比,低溫處理后垂穗披堿草葉片中電導率含量顯著增加了57.28%(P< 0.05)。與低溫處理相比，T1，T2，T3和T4處理葉片相對電導率分別將低了15.07%，18.82%，46.01%和46.38%(P< 0.05)。其中T4的處理效果最好(圖c)。

圖1 低溫(4℃)脅迫下噴施EBR對垂穗披堿草幼苗的表型(a)，幼苗鮮重(b)和相對電導率(c)的影響Fig.1 The effects of EBR on phenotypic characteristics (a),fresh weight (b),and relative conductivity of E.nutans seedlings under low temperature stress注：CK：常溫;4℃：低溫處理;T1:4℃+0.001 μmol·L-1 EBR;T2:4℃+0.01 μmol·L-1 EBR;T3:4℃+0.1 μmol·L-1 EBR;T4:4 ℃+1μmol·L-1 EBR,不同小寫字母表示不同處理之間的差異顯著性(P<0.05),下同Note:CK:control;4℃:Low temperature treatment;T1:4℃+0.001 μmol·L-1 EBR;T2:4℃+0.01 μmol·L-1 EBR;T3:4℃+0.1 μmol·L-1 EBR;T4:4℃+1 μmol·L-1 EBR. Different lowercase letters above the columns mean significant difference among different treatments at the 0.05 level,bars represent SE. The same as below

2.2 EBR對低溫脅迫下野生垂穗披堿草幼苗葉片中丙二醛(MDA)含量的影響

如圖2可知，低溫脅迫(4℃)下，垂穗披堿草葉片中MDA含量顯著高于CK。與CK相比，低溫處理導致垂穗披堿草葉片中MDA含量增加了61.87%(P< 0.05)。而低溫脅迫下，葉面積噴施EBR能夠顯著地降低MDA的積累。4℃+EBR處理中垂穗披堿草葉片中MDA含量較4℃單獨處理降低了20.73%(P< 0.05)。而對照條件下噴施EBR與CK無顯著性差異(P<0.05)。

圖2 噴施EBR對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗MDA的影響Fig.2 Effect of EBR on MDA content of E.nutans seedlings under low temperature stress

2.3 EBR對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗超氧陰離子自由基的影響

2.4 EBR對低溫脅迫下野生垂穗披堿草幼苗葉片中抗氧化酶活性的影響

低溫脅迫下，抗氧化酶SOD、APX和GR活性與CK相比呈現增加趨勢，而CAT和POD活性則表現為下降趨勢(圖4)。葉面積噴施EBR和低溫脅迫協(xié)同作用能夠進一步提高SOD、APX、GR和CAT活性。與低溫脅迫相比，4℃+EBR處理后垂穗披堿草葉片中SOD，CAT，APX和GR活性分別增加了27.04%，24.65%，45.85%和52.44%。與CK相比，低溫處理后垂穗披堿草葉片中APX活性顯著增加(圖4d)。在CK條件下，葉面積噴施EBR對上述抗氧化酶活性影響較小，與CK處理相比差異未達到顯著性水平。

圖3 噴施EBR對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗超氧陰離子自由基的影響Fig.3 Effect of EBR on content of E. nutans seedlings under low temperature stress

圖4 EBR處理低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗SOD (a)，POD (b)，CAT (c)，APX (d) 和GR (e)活性的影響Fig.4 Effect of EBR on activities of SOD (a),POD (b),CAT (c),APX (d) and GR (e) of E.nutans under low temperature stress

2.5 EBR對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量的影響

低溫脅迫下垂穗披堿草葉片中AsA和GSH含量均降低，但與CK未達到差異顯著性水平。EBR處理與低溫協(xié)同處理后，AsA和GSH含量與低溫脅迫單獨處理相比分別顯著提高了45.85%和81.90%(P< 0.05)；而ASA含量在CK下EBR處理對AsA含量影響較小，與CK相比無顯著性差異。在CK條件下，葉面積噴施EBR顯著提高了GSH含量。與CK相比，外源EBR處理后GSH含量增加43.13%(P<0.05)。

圖5 噴施EBR對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗抗壞血酸(a)和谷胱甘肽(b)含量的影響Fig.5 Effect of EBR on AsA (a) and GSH (b) content of E. nutans seedlings under low temperature stress

2.6 EBR對低溫脅迫下垂穗披堿草葉片中脯氨酸積累的影響

由圖5可知，與CK相比，低溫脅迫垂穗披堿草幼苗葉片中脯氨酸含量顯著增加。低溫條件下，噴施EBR能夠進一步提高脯氨酸的積累；比4℃處理相比，4℃+EBR處理后脯氨酸含量增加了24.64%。而CK條件下噴施EBR對脯氨酸含量無顯著性影響。

圖6 噴施EBR對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗游離脯氨酸含量的影響Fig.6 Effect of EBR on proline content of E. nutans seedlings under low temperature stress

3 討論

植物在遭受低溫脅迫時,其形態(tài)和生理響應等發(fā)生改變[12-13]。植物的細胞膜系統(tǒng)是感受低溫脅迫的首要部位。低溫脅迫導致細胞膜透性增大，膜脂過氧化作用加劇。相對電導率是反映植物細胞膜受逆境損傷的一個重要指標，MDA是膜脂過氧化產物，其含量的多少也能夠反應逆境下植物受損傷的程度[14]。本研究結果表明，低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗葉片中相對電導率和MDA含量增加，葉面積噴施EBR能顯著降低了相對電導率和MDA的含量，說明EBR處理能夠減輕低溫引起的膜脂過氧化作用，從而緩解低溫對垂穗披堿草細胞膜造成的傷害。

植物遭遇低溫脅迫時，細胞內活性氧代謝失衡，活性氧大量積累，從而造成細胞膜系統(tǒng)發(fā)生嚴重的氧化損傷[15]。為防止細胞內過量積累的活性氧對植物造成的氧化損傷，低溫脅迫誘導植物體內抗氧化防御體系活性增加，從而避免或減輕活性氧對植物造成的傷害?？寡趸到y(tǒng)包括抗氧化酶體系和非酶抗氧化體系[16]?？寡趸窼OD，POD,CAT及AsA-GSH循環(huán)能夠有效地清除過量積累的活性氧。SOD是植物細胞中第一道抗氧化防線，能夠將超氧陰離子自由基轉換為過氧化氫(H2O2),POD和CAT能夠將H2O2進一步分解，緩解由于活性氧大量積累對細胞的傷害(Mittler 2002)。APX和GR是AsA-GSH循環(huán)的關鍵酶，能夠高效的清除細胞內大量積累的活性氧[17]。本研究中，低溫下垂穗披堿草幼苗葉片的SOD,APX,GR活性增加，而噴施EBR能夠進一步顯著地提高這些酶活性并且降低氧自由基含量，表明EBR能夠誘導抗氧化酶活性增強，有效地清除大量積累的活性氧，減輕膜脂過氧化程度，從而增強垂穗披堿草的耐寒性。這與甄鵬等[18]研究結果一致，他指出BRs處理可以緩解低溫脅迫對苦瓜幼苗造成的生長抑制，減緩葉片中MDA的積累，同時可以顯著降低細胞質相對電導率，增強POD和SOD活性。陳善娜等[19]研究也發(fā)現，低溫脅迫下采用BR預處理可以提高植物POD和SOD活性，減少MDA的積累。低溫逆境下較高的AsA和GSH含量有利于維持植物細胞內的活性氧代謝平衡。本研究顯示，低溫脅迫下葉面積噴施EBR能夠提高AsA和GSH含量，這與前人研究結果一致。

脯氨酸作為重要的滲透調節(jié)物質有利于維持或降低植物體內細胞滲透勢，在保護蛋白質分子、抵御氧化脅迫，減輕低溫對細胞膜的傷害等方面具有重要作用[21]。低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗葉片中游離脯氨酸的含量顯著增加。噴施EBR能夠進一步促進低溫脅迫下垂穗披堿草葉片中脯氨酸的積累。這表明EBR能夠通過提高脯氨酸的積累來提高植物的低溫抗性，這與前人在其他作物上的研究是一致[20-23]。

4 結論