趙 越 阮祥燕,2* 王鳳春 李揚(yáng)璐 程姣姣 Alfred O. Mueck,2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026；2. 德國(guó)圖賓根大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)院婦女健康部與婦女健康研究中心，圖賓根 D-72076，德國(guó)；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)房，北京 100026)

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)是女性在40歲之前卵巢活動(dòng)衰退的臨床綜合征，以月經(jīng)紊亂(如停經(jīng)或稀發(fā)月經(jīng))、卵巢萎縮、體內(nèi)雌激素水平低落、促性腺激素高達(dá)絕經(jīng)期水平的現(xiàn)象，繼續(xù)進(jìn)展在40歲前卵巢功能衰竭，就會(huì)導(dǎo)致卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)，嚴(yán)重影響女性生殖健康和內(nèi)分泌平衡[1]。由于國(guó)內(nèi)缺乏權(quán)威的流行病學(xué)調(diào)查，以往文獻(xiàn)[2]顯示卵巢早衰在育齡女性中發(fā)病率約為1%。在當(dāng)今高壓力、快節(jié)奏的影響下，POI發(fā)病率呈上升和年輕化趨勢(shì)，已影響了超過(guò)10%的女性健康[3]。POF治療極為困難，即使通過(guò)輔助生殖技術(shù)，也很難實(shí)現(xiàn)受孕[4]，POI導(dǎo)致的生育力喪失及低雌激素狀態(tài)給女性生殖健康帶來(lái)了巨大威脅。鑒于常規(guī)治療方法的局限性，臨床和科研工作的關(guān)注點(diǎn)集中在改善POI患者卵巢功能及恢復(fù)生育能力。人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)，來(lái)源豐富，易采集，病原微生物感染率和免疫原性較低，無(wú)致瘤性和倫理限制等優(yōu)點(diǎn)[5-7]，為改善POI/POF患者卵巢功能及恢復(fù)生育能力帶來(lái)了希望，相關(guān)分子機(jī)制的探究更是為POI/POF合并不孕癥患者精準(zhǔn)治療提供了一個(gè)很有價(jià)值的研究方向。研究[8]表明，短期低氧刺激在早期會(huì)抑制細(xì)胞的活力及增生，引起細(xì)胞損傷甚至凋亡，但隨后細(xì)胞為了適應(yīng)低氧環(huán)境，又反而會(huì)增強(qiáng)其遷移能力，激活一些促進(jìn)存活的信號(hào)通路，表達(dá)一些生長(zhǎng)因子等，如低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)等。本研究應(yīng)用hUCMSCs來(lái)治療因化學(xué)治療藥物引起的POI小鼠，同時(shí)與低氧預(yù)處理的hUCMSCs治療效果進(jìn)行比較，通過(guò)檢測(cè)小鼠血中激素水平及小鼠卵泡發(fā)育情況，研究hUCMSCs及低氧預(yù)處理?xiàng)l件下hUCMSCs對(duì)POI小鼠的治療作用，為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)CD-1小鼠，雌性，6～7周齡，60只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，飼養(yǎng)所用食物、墊料、水、籠具等均經(jīng)嚴(yán)格消毒滅菌處理，按首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(倫理編號(hào)：AEEI-2015-112)。

1.2 主要試劑及儀器

1, 4-丁二醇二甲烷磺酸鹽(白消安)及環(huán)磷酰胺單水合物，購(gòu)自上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司。鼠雌二醇(estradiol，E2)ELISA試劑盒、鼠卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)ELISA試劑盒及鼠抗苗勒管激素(anti Müllerian hormone, AMH)ELISA試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。PE鼠抗人CD73、APC鼠抗人CD90、BV421鼠抗人CD105、APC鼠抗人CD14、APC鼠抗人CD19、APC鼠抗人CD34、 APC鼠抗人CD45、APC鼠抗人人白細(xì)胞抗原-D(human leukocyte antigen-D，HLA-DR)抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。Multiskan FC型酶標(biāo)儀、3111型二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 hUCMSCs的取材、分離、培養(yǎng)、鑒定及低氧誘導(dǎo)

選取自然分娩健康足月新生兒的健康產(chǎn)婦共20例，無(wú)任何疾病史，定期產(chǎn)檢，無(wú)任何產(chǎn)科合并癥，同時(shí)排除梅毒、肝炎、艾滋病等傳染病，經(jīng)產(chǎn)婦同意，胎盤(pán)娩出后，無(wú)菌條件下留取新鮮臍帶組織10 cm，臍帶中無(wú)明顯血管迂曲，放在組織保存液中。實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。所有入組參加研究者均自愿簽署知情同意書(shū)。

臍帶采集后在6 h內(nèi)進(jìn)行處理，將臍帶雙側(cè)帶夾痕及瘀血的部分切除，并剃除臍帶中的靜脈及動(dòng)脈，將剩余組織剪成3.0～5.0 mm3小塊，種入預(yù)先用少量完全培養(yǎng)基濕潤(rùn)的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶底壁，將培養(yǎng)瓶底壁朝上置于37 ℃、為5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2飽和濕度孵箱中，過(guò)夜后翻轉(zhuǎn)。每24 h加入1 mL上述培養(yǎng)基，72 h后全量換液，以后每周換液2次。觀察貼塊周?chē)N壁細(xì)胞爬出情況。2周后去貼塊，于培養(yǎng)的第14天計(jì)數(shù)集落數(shù)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)，以含1.25 g/L胰蛋白酶、1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以2.5×103～5.0×103/cm2密度接種傳代培養(yǎng)，計(jì)為第1代(P1)細(xì)胞。取第2代的間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液。分別加入抗人CD29、CD44、CD73、CD105、CD90、CD14、CD34、CD45、CD106、CD133、HLA-DR單抗各5 μL，鼠IG為陰性對(duì)照，4 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

低氧誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟為上述正常培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，置于37 ℃，充滿(mǎn)體積分?jǐn)?shù)為1% O2、5% CO2及94%氮?dú)獾呐囵B(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)48 h，收取細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液。未進(jìn)行低氧誘導(dǎo)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞則當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到 70%～80% 融合時(shí)，收取細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液。

1.4 小鼠POF模型建立及干細(xì)胞治療

雌性CD-1小鼠60只，在動(dòng)物房后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始建模。按體質(zhì)量采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組15只，分別為：正常對(duì)照組(A組)、POF模型對(duì)照組(B組)、 hUCMSCs組(C組)、低氧hUCMSCs組(D組)。除A組外，各組小鼠分別皮下注射白消安(12 mg/kg，溶于DMSO)和腹腔注射環(huán)磷酰胺[120 mg/kg，溶于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液]，A組分別注射等體積DMSO和0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，每日8∶ 00棉簽輕取陰道分泌物涂片，巴氏染色，觀察陰道脫落細(xì)胞變化，當(dāng)連續(xù)10 d觀測(cè)到持續(xù)動(dòng)情間期，視為POI建模成功[6]，造模1周后給藥。C組和D組小鼠分別靜脈注射hUCMSCs單細(xì)胞混懸液和低氧誘導(dǎo)hUCMSCs單細(xì)胞混懸液(100 μL每鼠，含細(xì)胞數(shù)量為2 × 106個(gè))。

1.5 觀察指標(biāo)

在實(shí)驗(yàn)第21天分別從各組中取5只小鼠，眼球采血，肝素抗凝，分離血漿于-80 ℃ 凍存，擇期檢測(cè)其E2、FSH、AMH含量；收集小鼠卵巢，以甲醛固定后，行組織病理學(xué)檢查，進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 hUCMSCs形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)分離、培養(yǎng)得到的hUCMSCs均貼壁生長(zhǎng)，呈均一的梭形，渦旋狀排列(圖1)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hUCMSCs表面標(biāo)志物

分離培養(yǎng)的第二代hUCMSCs流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性標(biāo)志物：CD73、CD90和CD105陽(yáng)性率均大于 95%，陰性標(biāo)志物：CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR均不高于2%(圖2)。

2.3 激素水平

與A組比較，B組小鼠血漿E2及AMH降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與B組比較，C組和D組的小鼠血漿中E2及AMH(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組小鼠血漿FSH有所上升，但各組差異無(wú)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖1 hUCMSCs光鏡圖Fig.1 Optical microscope of hUCMSCshUCMSCs: human umbilical cord mesenchymal stem cells.

圖2 hUCMSCs表面標(biāo)志物的流式鑒定Fig.2 Flow characterization of surface markers of hUCMSCshUCMSCs: human umbilical cord mesenchymal stem cells.

GroupNumberofcasesE2/(pmol·L-1)FSH/(mIU·mL-1)AMH/(pg·mL-1)A1536.96±2.886.35±2.612923.75±166.98B1531.71±3.49?6.77±2.362221.53±249.25?C1534.21±3.22#6.15±2.582513.50±240.51#D1534.43±3.16#6.29±2.252679.82±126.24#F-11.691.388.50P-0.0280.3050.003 ?P<0.05vsgroupA;#P<0.05vsgroupB;E2:estrogen;FSH:folliclestimulatinghormone;AMH:anti-Müllerianhormone;hUCMSCs:humanumbilicalcordmesenchymalstemcells;A:control;B:POFcontrol;C:normalhUCMSCs;D:hypoxicpretreatedhUCMSCs;POF:prematureovarianfailure.

2.4 卵巢組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察和各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)

采取連續(xù)切片法，每張切片厚度5μm，取10張切片，常規(guī)HE染色，鏡下觀察各組標(biāo)本的切片中各階段(始基卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和成熟卵泡、閉鎖卵泡)卵泡情況，同時(shí)觀察卵巢中顆粒細(xì)胞、黃體及間質(zhì)等組織學(xué)變化。結(jié)果顯示，A組小鼠卵巢體積較大，可見(jiàn)生長(zhǎng)活躍、發(fā)育良好的各級(jí)卵泡和黃體，卵巢組織未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。B組小鼠卵泡萎縮明顯，結(jié)構(gòu)混亂，各階段生長(zhǎng)卵泡數(shù)目明顯減少，僅有少數(shù)原始卵泡，卵巢卵母細(xì)胞周邊顆粒細(xì)胞明顯減少、排列紊亂、細(xì)胞間隙增大。C、D組卵巢組織中空泡及閉鎖卵泡明顯減少，顆粒細(xì)胞數(shù)量增多且呈放射狀整齊排列，并開(kāi)始出現(xiàn)各級(jí)卵泡，成熟卵泡明顯增多，可見(jiàn)較多排卵前的竇狀卵泡。卵巢顏色紅潤(rùn)，尺寸增大，透明度好，整體來(lái)看與A組卵巢狀態(tài)相似(圖3)。與A組相比，B組原始卵泡、生長(zhǎng)卵泡數(shù)量明顯減少(P<0.05)、閉鎖卵泡數(shù)量明顯增多(P<0.05)；與B組相比，C、D組生長(zhǎng)卵泡明顯增多、閉鎖卵泡明顯減少(P<0.05)。與C組相比，D組生長(zhǎng)卵泡數(shù)量有增加趨勢(shì)、閉鎖卵泡數(shù)量趨于減少，在21 d治療時(shí)間點(diǎn)兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表2。

圖3 各組小鼠卵巢組織HE染色結(jié)果Fig.3 HE staining results of ovarian tissue in each group of mice

A:control;B:POF control;C:normal hUCMSCs;D:hypoxic pretreated hUCMSCs;A1、B1、C1、D1:HE staining (10×),A2、B2、C2、D2:HE staining (40×);hUCMSCs: human umbilical cord mesenchymal stem cells;POF:premature ovarian failure;HE:hematoxylin and eosin.

GroupNumberofcasesPrimordialfolliclesGrowingfolliclesAtreticfolliclesA1573.20±6.02161.05±34.2425.40±4.38B1559.67±7.89?99.82±33.51?35.80±2.95?C1560.32±5.72143.49±25.54#20.62±2.79#D1558.43±5.05148.80±23.39#19.66±2.45#F-8.1210.899.66P-0.0470.0290.039 ?P<0.05vsgroupA;#P<0.05vsgroupB;A:control;B:POFcontrol;C:normalhUCMSCs;D:hypoxicpretreatedhUC-MSCs;hUCMSCs:humanumbilicalcordmesenchymalstemcells;POF:prematureovarianfailure.

3 討論

POI已成為威脅正常生育年齡女性生殖系統(tǒng)健康的最大問(wèn)題之一，其發(fā)生可能與各種原因引起的始基卵泡池儲(chǔ)備不足、卵泡閉鎖加速、優(yōu)勢(shì)卵泡募集改變、卵泡成熟障礙等有關(guān)[9-10]。近年來(lái)，采用間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植治療開(kāi)拓了POI治療全新的方向，但大部分處于臨床前研究階段[11-13]，臨床研究鮮有報(bào)道，而且對(duì)MSC改善卵巢功能的作用機(jī)制尚不完全清楚，目前臨床尚沒(méi)有明確有效的治療措施能恢復(fù)其生殖功能。

本課題組成功建立了hUCMSCs分離培養(yǎng)鑒定的全套技術(shù)設(shè)備。流式技術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面特異性抗原CD44和CD90，不同傳代次數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性率均保持在99%水平，提示本研究中分離培養(yǎng)的hUCMSCs純度較高，分離和培養(yǎng)方法合適，符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(International Society for Cell Therapy, ISCT) MSCs表型鑒定標(biāo)準(zhǔn)[14]。本研究采用化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)的小鼠POI模型來(lái)評(píng)價(jià)正常培養(yǎng)下hUCMSCs及低氧預(yù)處理hUCMSCs對(duì)POI的治療作用，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)治療組血中E2及AMH濃度較治療前明顯增加，說(shuō)明hUCMSCs移植治療改善了卵巢早衰小鼠的卵巢內(nèi)分泌水平，增加了卵巢儲(chǔ)備功能，從而延緩卵巢功能衰退。同時(shí)組織病理學(xué)結(jié)果證實(shí)，經(jīng)hUCMSCs移植治療后，POI小鼠卵泡的數(shù)量和質(zhì)量都得到一定程度的恢復(fù)，各級(jí)卵泡的比例也趨向于正?；?，說(shuō)明干細(xì)胞移植后促進(jìn)了POI小鼠卵巢中卵泡的恢復(fù)及再生，進(jìn)一步證實(shí)了hUCMSCs對(duì)POI的治療效果，與以往報(bào)道[15-16]類(lèi)似。干細(xì)胞移植入體內(nèi)后面臨氧分壓、炎性環(huán)境等復(fù)雜的微環(huán)境，對(duì)其存活及進(jìn)一步的療效都可能產(chǎn)生負(fù)面的影響，而經(jīng)短期低氧預(yù)處理后，干細(xì)胞會(huì)活化一些利于其適應(yīng)低氧環(huán)境的信號(hào)通路，增強(qiáng)其可塑性、血管再生能力等，同時(shí)調(diào)控多種生長(zhǎng)因子的分泌，以利于其存活[17-18]。本研究中低氧預(yù)處理MSC組小鼠在血漿E2及AMH濃度、生長(zhǎng)卵泡和閉鎖卵泡數(shù)量方面，均較正常MSC治療組出現(xiàn)對(duì)療效更有利的趨勢(shì)，這也在一定程度上印證了低氧預(yù)處理干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。

本研究為hUCMSCs治療POI進(jìn)一步的臨床前研究提供了理論基礎(chǔ)和啟示，但在hUCMSCs促進(jìn)卵泡恢復(fù)的詳細(xì)機(jī)制、移植方式、移植部位與數(shù)量、移植時(shí)間窗、移植后干細(xì)胞的歸巢、移植前對(duì)干細(xì)胞的處理和改造，以及后期臨床上卵巢功能恢復(fù)評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇等方面，尚需要進(jìn)一步的探索，以便充分發(fā)揮干細(xì)胞的治療效果。