劉玉冰，梁鉆好，黎 攀，夏 雨，吳俏槿，杜 冰

（1.廣州丹吉兒生物科技有限公司，廣東廣州 510642；2.陽江職業(yè)技術(shù)學院，廣東陽江 529566；3.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642；4.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東中山 528437）

砂仁，姜科，豆蔻屬多年生草本植物，與檳榔、益智仁、巴戟天并稱“四大南藥”。砂仁集中分布于我國福建、廣東、廣西和云南等地。中醫(yī)和臨床驗證認為砂仁具有暖脾止瀉、化濕開胃、鎮(zhèn)痛、行氣安胎、解酒醒神等功效[1-2]，其中主要的藥理活性成分以揮發(fā)性油和黃酮類物質(zhì)為主。砂仁富含黃酮類物質(zhì)（不同產(chǎn)地的平均含量為0.25～0.90 mg/g）[3-4]，目前已從砂仁的水溶性成分中分離鑒定出槲皮苷、異槲皮苷和槲皮素[4-5]3種黃酮類物質(zhì)。黃酮類物質(zhì)具有很強的抗氧化和清除自由基的能力，不僅可以賦予飲料保健功效，還令飲料口感圓潤。

植物次生代謝產(chǎn)物的微生物轉(zhuǎn)化是近年來的研究熱點[6]，而且有研究表明，微生物發(fā)酵可提高中草藥的黃酮含量。如酵母菌[7]和黑曲霉[8]發(fā)酵黃芪可分別提高黃酮含量18%和129%；米曲霉和米根霉發(fā)酵紫米也可大幅提高（190.1%和122.5%） 總黃酮含量[9]；釀酒酵母發(fā)酵風柜斗草所獲得的發(fā)酵液中總黃酮含量是水提液的2.6倍，其DPPH自由基和羥自由基清除能力均優(yōu)于水提液的[10]。黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化的常規(guī)菌種為大腸桿菌[11-12]和釀酒酵母[13-14]，還可以考慮絲狀真菌、乳酸菌、芽孢桿菌等其他微生物[15]。微生物的轉(zhuǎn)化作用是復雜的，菌種、營養(yǎng)環(huán)境、原料特征等都會影響具有生物活性的次生代謝物的轉(zhuǎn)化。如李寧等人[16]篩選的6株菌株中，只有1株具有高效轉(zhuǎn)化藜蒿水提液總黃酮含量的能力，其他5株都會降低或不改變藜蒿水提液的黃酮含量。產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106（Bacillus sp.DU-106） 是經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學鑒定的一株新的芽孢桿菌屬[17]，已應用于多種中草藥[18-20]、谷物[21]、果蔬[22]的發(fā)酵中，其發(fā)酵飲料口感和風味均較佳。試驗采用產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵砂仁，探究發(fā)酵工藝對砂仁發(fā)酵飲料中總黃酮含量的影響，為砂仁黃酮的微生物轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南砂仁，購于當?shù)厮幍?；產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106（Bacillus sp.DU-106），篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪，由華南農(nóng)業(yè)大學新資源食品與功能性原料評價及研究中心鑒定和保藏；橙皮苷標準品，HPLC＞98%；氯化鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、二甘醇，均為分析純。

FA2004A型分析天平，上海精天電子儀器廠產(chǎn)品；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市華普達數(shù)學儀器有限公司產(chǎn)品；DHP-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；752-N型紫外分光光度計、PHs-3C型精密pH計，上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；WYT型手持糖量計，泉州中友光學儀器有限公司產(chǎn)品；VD-650型桌上式潔凈式工作臺、DF-101S型高壓滅菌鍋，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 菌種活化

0.1 g產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106菌粉溶于100 mL已滅菌并冷卻至室溫的生理鹽水中，于30℃下活化30 min，得到菌種活化液。

1.2.3 單因素試驗

稱取去殼砂仁50 g，洗凈后用100℃水熱燙1～3 min，瀝干水分，用紗布包好后加入300 mL煮沸放涼的水（內(nèi)含30 g溶化的白砂糖），接種發(fā)酵（發(fā)酵期間用已消毒的小石頭把砂仁壓下去，確保砂仁不上浮在液面）。固定發(fā)酵溫度26℃，發(fā)酵時間4 d，分別接種0.6%，1.8%，3.0%，4.2%，5.4%菌種活化液（以去殼砂仁的量計算），考查接種量對發(fā)酵飲料總黃酮含量的影響；固定接種量為3.0%，發(fā)酵溫度26℃，分別發(fā)酵2，3，4，5，6 d，考查發(fā)酵時間對發(fā)酵飲料總黃酮含量的影響；固定接種量為3.0%，發(fā)酵時間4 d，分別在20，23，26，29，32℃下發(fā)酵，考查發(fā)酵溫度對發(fā)酵飲料總黃酮含量的影響。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行L9（34）正交試驗，以接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間為因素，每個因素各取3個水平。以總黃酮含量為指標，得出砂仁飲料發(fā)酵的最佳條件。

1.2.5 指標測定

總黃酮含量：參照NY/T 2010—2011柑橘類水果及制品中總黃酮含量的測定的方法測定發(fā)酵液中總黃酮含量；可溶性固形物含量采用手持糖量計測定；pH值采用pH計測定。

黃酮標準曲線見圖1。

圖1 黃酮標準曲線

1.2.6 感官評價

參照NY 82.2—1988果汁測定方法感官檢驗對砂仁發(fā)酵飲料進行感官評分。選取12名有經(jīng)驗的發(fā)酵飲料人員進行感官評價，得到的結(jié)果去掉最高值和最低值后取平均值。

砂仁發(fā)酵飲料評分細則見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對總黃酮含量的影響

表1 砂仁發(fā)酵飲料評分細則

接種量對砂仁飲料總黃酮含量的影響見圖2。

圖2 接種量對砂仁飲料總黃酮含量的影響

由圖2可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵飲料中總黃酮含量不斷增加，當接種量增加到4.2%時，飲料中總黃酮含量達到最高值，比0.6%的接種量高出34.4%。隨后接種量繼續(xù)增加，總黃酮含量略有下降。因此，以4.2%的接種量為宜。

研究表明，部分芽孢桿菌菌株可高效轉(zhuǎn)化黃酮類物質(zhì)[15-16]。產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106為芽孢桿菌屬，兼性厭氧，一定的接種量可以加快消耗原料中的少量氧氣[19]，促進繁殖和發(fā)酵的同時避免所轉(zhuǎn)化的黃酮被氧化，確保黃酮保留高抗氧化活性。但是當接種量過大時，微生物繁殖過量，營養(yǎng)受限，發(fā)酵作用會受到抑制[19]，阻礙轉(zhuǎn)化。

2.2 發(fā)酵時間對總黃酮含量的影響

發(fā)酵時間對砂仁飲料總黃酮含量的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對砂仁飲料總黃酮含量的影響

由圖3可知，發(fā)酵時間較短時，飲料中總黃酮含量緩慢增加，發(fā)酵時間延長（3～4 d），總黃酮含量急劇增加，并在5 d達到最高值0.632 mg/g，隨后發(fā)酵時間繼續(xù)延長，總黃酮含量略有下降。

由于微生物菌株差異較大，其對黃酮的轉(zhuǎn)化速率也存在較大的差異，高效轉(zhuǎn)化時間從幾小時到幾天不等[16，23]。趙丹等人[9]采用米根霉發(fā)酵紫米，于27℃下發(fā)酵2.5 d獲得最高黃酮含量（0.222 mg/g），郝紅梅等人[7]采用酵母發(fā)酵黃芪，于28℃下發(fā)酵7 d獲得最高黃酮含量（2.212 mg/g）。從總黃酮含量-發(fā)酵時間的變化曲線來看，試驗采用的產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106在26℃下發(fā)酵砂仁，最適發(fā)酵時間為4～6 d。

2.3 發(fā)酵溫度對總黃酮含量的影響

發(fā)酵溫度對砂仁飲料總黃酮含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對砂仁飲料總黃酮含量的影響

發(fā)酵溫度對飲料中總黃酮含量有顯著影響。20～29℃時，飲料中總黃酮含量幾乎隨發(fā)酵溫度的增加呈直線上升，溫度每上升1℃，總黃酮含量增加0.040 mg/g。發(fā)酵溫度為29℃時，總黃酮含量是發(fā)酵溫度為20℃時的2倍以上。隨后發(fā)酵溫度繼續(xù)上升，變化曲線趨于平緩。

產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106轉(zhuǎn)化砂仁總黃酮含量的最佳溫度為29～32℃，與李寧等人[16]篩選芽孢桿菌屬菌株轉(zhuǎn)化藜蒿水提液總黃酮含量的最佳溫度（30℃）一致。一方面，這與產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106最適活化溫度30℃有關(guān)，另一方面體現(xiàn)了微生物對植物次生代謝物的轉(zhuǎn)化通常在溫和條件下進行[6]，相比黃酮的常規(guī)高溫熱水（85～100℃） 浸提法或有機溶劑浸提法，微生物轉(zhuǎn)化法具有反應條件溫和、環(huán)境友好化、避免有機溶劑殘留或污染等問題。再者，由于溫和反應，相比常規(guī)的熱水浸提法，微生物所轉(zhuǎn)化的黃酮類物質(zhì)可能獲得更高的活性[10，23-24]。

2.4 正交優(yōu)化試驗

因素與水平設(shè)計見表2，L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析見表3。

表2 因素與水平設(shè)計

由表3極差分析得知，采用產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵砂仁，影響總黃酮含量的因素順序為C＞A＞B，即發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間。

正交試驗方差分析見表4，砂仁發(fā)酵飲料物化指標見表5。

表4方差分析顯示，因素C的影響達到高度顯著水平（p＜0.01），因素A和B的影響未達到顯著水平（p＞0.05），與直觀分析結(jié)果一致。

最佳工藝條件為A2B1C2，即接種量4.2%，發(fā)酵時間4 d，發(fā)酵溫度29℃，在此條件下得到的總黃酮含量為0.725 mg/g。測得該條件下的砂仁發(fā)酵飲料的pH值為4.23，可溶性固形物含量為5.74%，感官評分16.9分，總體評價好。

表3 L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

表4 正交試驗方差分析

表5 砂仁發(fā)酵飲料物化指標

3 結(jié)論

利用產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106轉(zhuǎn)化砂仁總黃酮，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交優(yōu)化試驗，得到最佳工藝條件。影響總黃酮含量的因素順序為發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間，接種量4.2%，發(fā)酵時間4 d，發(fā)酵溫度29℃，此時砂仁發(fā)酵飲料可獲得高達0.725 mg/g的總黃酮，對應的飲料pH值為4.23，可溶性固形物含量為5.74%，感官評分16.9分。微生物轉(zhuǎn)化反應條件溫和、轉(zhuǎn)化率高，同時有望獲得高活性的黃酮類物質(zhì)，賦予中草藥發(fā)酵飲料更佳的保健功效。