張彩麗 張亦斌 鄧盛齊 張金霞 羅玉瑩

(1 抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，成都大學(xué)，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610052)

脂質(zhì)體作為新型的藥物傳遞載體，具有良好的靶向性和生物相容性[1]。然而常規(guī)脂質(zhì)體在進入人體后，仍然會被肝和脾臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system,RES)迅速識別和攝取，從而縮短藥物的血漿半衰期[2]。此外，脂質(zhì)體主要通過內(nèi)吞小泡的方式進入細胞，隨后進入溶酶體，最終脂質(zhì)體和被包封的藥物仍然無法避免被溶酶體降解的風(fēng)險。

為解決這一問題，大量物理響應(yīng)、化學(xué)響應(yīng)和生物響應(yīng)的納米材料被用于脂質(zhì)體藥物傳遞系統(tǒng)[2-3]，其中pH敏感脂質(zhì)體被視為避免藥物被溶酶體降解的最有效途徑之一。由于較高的代謝速率，腫瘤組織的pH值(5.3～6.3)通常低于正常組織，亞細胞水平內(nèi)涵體和溶酶體的pH值通常在4.5～5.5之間，這些不同組織和器官之間pH的差異為pH敏感脂質(zhì)體的設(shè)計提供了思路[4]。通常pH敏感脂質(zhì)體在中性和弱堿性條件下較穩(wěn)定，而酸性條件下不穩(wěn)定[5]，當(dāng)pH值從生理環(huán)境7.4變到腫瘤組織微環(huán)境5.3～6.3時，pH敏感脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)也將發(fā)生相應(yīng)的改變，從而釋放內(nèi)容物[6]，發(fā)揮抗腫瘤效果。因此，pH敏感脂質(zhì)體對抗腫瘤藥物的研發(fā)具有重要的研究價值。

雷替曲塞是一種胸腺嘧啶合成酶抑制劑，1996年在英國上市，目前國內(nèi)外的上市制劑為注射用凍干粉針，已有16個國家將其作為治療晚期結(jié)直腸癌的一線藥物[7]。由于不能有效區(qū)分正常細胞和快速增長的腫瘤細胞，使得其到達腫瘤組織的藥量較少、不良反應(yīng)較大[8-9]。為進一步發(fā)揮其一線治療的作用，做創(chuàng)新性的制劑改良非常必要。本研究制備雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體，并對其處方和制備工藝進行優(yōu)化，然后對所優(yōu)化的pH敏感脂質(zhì)體進行評價，以期望提高雷替曲塞抗腫瘤作用的靶向性，更好的發(fā)揮其抗腫瘤作用。為開發(fā)具有靶向作用的雷替曲塞新型藥物傳遞系統(tǒng)提供相應(yīng)的理論依據(jù)與實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司，LC-20AT泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A檢測器、Chromato-Solution Light色譜工作站)，pH酸度計(Mettler Toledo，型號：092ZY619)，臺式微量高速離心機(湘儀?，型號：H1650-W)，超聲波細胞破碎儀(沃信儀器，型號：VOSHIN92-Ⅱ)，十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司，型號：CPA225D)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：20151345)、激光粒度儀/Zeta電位分析儀(英國Malvern，zetasizer nano ZS90)、酶標(biāo)儀(Biotek公司，型號：Bio-TekELX800)、細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，型號：HERAcell 2401)。

1.2 材料

雷替曲塞(北京邁勁醫(yī)藥科技有限公司，純度＞99%)，雷替曲塞對照品(北京邁勁醫(yī)藥科技有限公司，純度99.3%)，甲醇、乙腈(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，色譜純)，葡聚糖凝膠G-50(瑞典Pharmacia公司)、磷脂酰乙醇胺(DOPE，瑞士Corden公司)、膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS，Sigma公司)、HSPC(日本精化株式會社)、PC-98T(日本精化株式會社)、Na3PO4、NaH2PO4、Na2HPO4等試劑(成都科龍試劑有限公司，分析純)、胎牛血清(Gibco公司)、10%FBS培養(yǎng)基(Gibco公司)、CCK8試劑(七海生物)、HCT-116細胞(ATCC)。

2 方法與結(jié)果

2.1 pH敏感脂質(zhì)體的制備

采用凍融法制備脂質(zhì)體。精密稱取處方量的脂質(zhì)材料DOPE和CHEMS溶于氯仿中，在40℃條件下通過減壓旋蒸法除去氯仿使形成均勻的脂質(zhì)體薄膜，真空干燥過夜；加入含處方量雷替曲塞的磷酸鹽緩沖液5mL；40℃水化1h，得雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體混懸液；經(jīng)超聲波細胞破碎儀破碎2min(破碎2S，間隔3S)后，-20℃/40℃條件凍融3次，即得雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體。

2.2 包封率的測定

采用SephadexG-50凝膠柱對游離藥物進行分離，測定脂質(zhì)體的包封率。精密移取雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體0.5mL，上樣，用0.05mol/L NaH2PO4(pH8.0)溶液進行洗脫(流速為3mL/min)，收集50mL游離藥物洗脫液，測定并計算脂質(zhì)體中游離藥物的質(zhì)量W游離。另精密移取雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體0.5mL于50mL量瓶中，加入一定量10% triton X-100溶解脂質(zhì)體，并用洗脫液定容至刻度，測定并計算脂質(zhì)體中總藥物的質(zhì)量W總，按包封率公式(包封率(EE/%)=(1-W游離/W總)×100%)計算脂質(zhì)體包封率。

2.3 含量測定

本實驗采用HPLC法測定雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體中藥物的含量。色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗：色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6mm×250mm,5μm)；流動相為pH7.25乙腈-磷酸鹽緩沖液(含0.25%磷酸二氫鈉和0.25%磷酸氫二鈉)=14:86；流速1.0mL/min；柱溫：40℃；進樣量20μL；檢測波長227nm。

2.4 單因素處方篩選(圖1)

2.4.1 磷脂種類對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響

磷脂雙分子層是組成脂質(zhì)體膜的主要成分，因此本實驗選用了3種不同的磷脂(HSPC、DOPE和PC-98T)制備pH敏感脂質(zhì)體，以考察磷脂種類對pH敏感脂質(zhì)體包封率的影響。結(jié)果表明磷脂種類對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體的粒徑和包封率都有較大的影響，其中，采用DOPE制備的雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體粒徑最小，且包封率最高。因此選用DOPE制備雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體。

2.4.2 DOPE與CHEMS比例對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響

DOPE和CHEMS是組成pH敏感脂質(zhì)體的主要成分，因此考察了DOPE與CHEMS比例(3:1、3:2和4:3，摩爾比)對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體包封率的影響。結(jié)果表明，二者的比例對脂質(zhì)體的粒徑影響不大，當(dāng)DOPE:CHEMS為3:2時所制備的雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體包封率最高。經(jīng)查閱文獻和前期預(yù)實驗知[10]，當(dāng)DOPE:CHEMS為3:2時所制備的pH敏感脂質(zhì)體pH敏感效果最好，所以選用摩爾比為3:2的DOPE和CHEMS制備雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體。

圖1 磷脂種類(A)、DOPE與CHEMS比例(B)、藥脂比(C)、水相pH(D)、緩沖液濃度(E)和超聲功率(F)對pH敏感脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(n=3,±s)Fig.1 Effect of the kind of lipid(A),mass ratio of DOPE to CHEMS(B),mass ratio of drug to lipid(C),the pH of aqueous(D),concentration of lipid(E),the energy of ultrasonic(F)on particle size and entrapment ef ficiency(n=3，±s)

2.4.3 藥脂比對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響

考察了藥脂比(3:10、1:10和1:20)對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體的影響，結(jié)果表明藥脂比對脂質(zhì)體的粒徑影響較小，對包封率的影響較大。因此，選擇藥脂比1:10～1:30用于后續(xù)多因素考察實驗。

2.4.4 水相pH對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響

因為制備脂質(zhì)體的膜材對pH較為敏感，所以水相(磷酸鹽緩沖液)pH對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體的包封率影響較大。本實驗考察了不同pH值磷酸鹽緩沖液(pH7.4～8.5)對pH敏感脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響。結(jié)果顯示水相pH越小時脂質(zhì)體越容易聚集且粒徑會變大，隨pH增大包封率也將變大。所以選擇水相pH值在8.0～9.0之間。

2.4.5 緩沖液濃度對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響

考察了不同濃度的磷酸鹽緩沖液(0.01、0.02和0.05mol/L)對脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響，結(jié)果表明，隨緩沖液濃度增大，脂質(zhì)體包封率逐漸增大而粒徑變化不明顯。因此選擇磷酸鹽緩沖液0.02～0.05mol/L用于后續(xù)多因素實驗。

2.4.6 超聲功率對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響

考察了超聲功率/能量(10%～30%，總功率為650w)對pH敏感脂質(zhì)體包封率的影響，結(jié)果表明隨超聲功率變大，pH敏感脂質(zhì)體的粒徑和包封率將逐漸減小，可能超聲功率過大將導(dǎo)致部分脂質(zhì)體破壞泄露出被包封的藥物。因此選擇超聲能量在10%～20%之間。

2.5 正交設(shè)計法優(yōu)化最佳處方

單因素考察實驗結(jié)果表明，在保證pH敏感和粒徑適當(dāng)?shù)那疤嵯?，藥脂?A)、水相pH(B)、緩沖液濃度(C)和超聲能量(D)為影響pH敏感脂質(zhì)體包封率的主要因素，因而選取這4個因素作為考查對象，采用L9(34)正交表設(shè)計實驗，以包封率為指標(biāo)進行評價，得到優(yōu)化的pH敏感脂質(zhì)體處方。結(jié)果見表1所示。

根據(jù)表1中極差R分析：A＞B＞D＞C，表明緩沖液濃度對雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體的包封率影響最小。以表1中R值最小的因素作為誤差估計，對正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表2。

表1 雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體制備工藝參數(shù)優(yōu)化Tab.1 Optimization of preparation parameters of raltitrexed pH-sensitive liposome

通過上述制備工藝參數(shù)的優(yōu)化，得到雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體的最優(yōu)制備處方條件，即以DOPE和CHEMS的摩爾比為3:2，藥脂比為1:20，水相為0.05mol/L NaH2PO4緩沖液(pH8.5)，超聲波細胞破碎儀的超聲能量為10%制備雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體。

2.6 pH敏感脂質(zhì)體的工藝確認

按最優(yōu)處方制備3批雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體(批號：052401、052402和052403)，以外觀性狀、粒徑及分布、多分散指數(shù)(PDI)、Zeta電位和包封率為評價指標(biāo)對制備的3批pH敏感脂質(zhì)體進行質(zhì)量評價。052402批樣品的粒徑分布和微觀形態(tài)如圖2所示，所制備的3批pH敏感脂質(zhì)體為白色泛藍色乳光的混懸液體，透射電鏡下觀察到所制備pH敏感脂質(zhì)體大小均一圓整，平均粒徑為(227.0±21.4)nm，PDI為0.223±0.061，Zeta電位為(-44.2±3.6)mV，包封率為(58.3±2.1)%。結(jié)果表明，按最優(yōu)處方制備的3批樣品，各項特性指標(biāo)均符合要求，質(zhì)量均一，工藝重現(xiàn)性較好。

表2 方差分析表[F0.05(2,2)=19.00]Tab.2 Variance analysis table[F0.05(2,2)=19.00]

圖2 雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體的透射電鏡圖及粒徑分布Fig.2 The TEM and size distribute of raltitrexed pH-sensitive liposome

2.7 體外釋放度考察

分別配置pH值為5.0、6.0和7.4的磷酸鹽緩沖液各25mL作為體外釋放介質(zhì)，取所制備的載藥脂質(zhì)體1mL于透析袋(截留分子量1000Da)中，將其置于上述釋放介質(zhì)內(nèi)，采用恒溫振蕩法，分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24和48h取樣1mL，補液1mL，計算累積釋放度，結(jié)果如圖3所示，載藥脂質(zhì)體在不同pH介質(zhì)中釋放規(guī)律不同，在腫瘤組織的酸性環(huán)境即pH5.0和pH6.0的釋放介質(zhì)中，釋放較快，在正常組織液環(huán)境即pH7.4的釋放介質(zhì)中，釋放緩慢，pH敏感作用明顯。

2.8 細胞毒性試驗

取對數(shù)生長期的HCT-116細胞懸液接種于96孔板，每孔100μL(約2000個細胞)，至于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。采用倍比稀釋法配制藥物濃度分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625μg/mL的脂質(zhì)體溶液作為載藥脂質(zhì)體組，空白脂質(zhì)體組為相對應(yīng)的脂質(zhì)體濃度的溶液。每孔加入100μL，每個濃度平行5孔，培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10μL CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2h，用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸收值，計算其細胞存活率。結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)，空白脂質(zhì)體無毒性，而載藥脂質(zhì)體抗結(jié)腸癌細胞的效果明顯(圖4)。

圖3 雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體在pH=5.0、6.0和7.4條件下的體外釋放度曲線(n=3,±s)Fig.3 In vitro release pro file of raltitrexed pH-sensitive liposome in PBS(pH=5.0,6.0 and 7.4)(n=3,±s)

3 結(jié)論與討論

雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體能夠在腫瘤組織微環(huán)境(pH5.0～6.5)中快速釋放，有較好的pH敏感作用。本研究通過處方條件的篩選和優(yōu)化，成功制備了負載雷替曲塞的pH敏感脂質(zhì)體。所制備的pH敏感脂質(zhì)體具有適宜的理化性質(zhì)，體外釋放具有pH敏感的作用，體外細胞毒性試驗證明了空白脂質(zhì)體載體的安全性，載藥脂質(zhì)體制劑對HCT-116細胞的毒性較高。

圖4 雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體的細胞毒性(n=5,±s)Fig.4 The cytotoxicity study of raltitrexed pH-sensitive liposome(n=5,±s)

對雷替曲塞藥物進行理化性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)雷替曲塞為水溶性藥物。由于水溶性藥物的油水分配系數(shù)受介質(zhì)的pH和離子強度影響較大、包封率條件不易控制，所以水溶性藥物的包封效果往往不如脂溶性藥物。除此之外，水溶性藥物可同時分布在脂質(zhì)體的內(nèi)水相和外水相，外水相體積通常比內(nèi)水相體積大得多，基于外水相的親和力和分散作用，藥物更趨向于分布在外水相中。因此，常常采用主動載藥法和逆相蒸發(fā)法等方法來制備包載水溶性藥物的脂質(zhì)體。通過前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，由于pH敏感膜材料的存在，采用主動載藥法制備雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體較為困難；而逆相蒸發(fā)法所制得的雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體包封率明顯低于薄膜法所制備的pH敏感脂質(zhì)體；所以最終確定雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體的制備方法為凍融法。但是，采用凍融法制備的雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體的包封率依舊只有60%左右。為了得到具有更高包封率的雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體，本研究采用葡聚糖凝膠色譜柱或動態(tài)膜透析法，對所得雷替曲塞pH敏感脂質(zhì)體中的游離藥物進行分離，最終所得包封率可達到90%。