周 翔

近年來，老年骨質(zhì)疏松癥(OP)的患病率增加，已成為常見的老年性疾病，嚴(yán)重影響老年人的健康[1,2]。隨著年齡增長，老年人激素水平顯著降低，炎癥因子表達(dá)升高，影響骨髓微環(huán)境中成骨細(xì)胞的生存，進(jìn)而導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，骨質(zhì)大量流失，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生[3～5]。成骨細(xì)胞在骨形成、骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其大多來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)[6]。BMSCs是一種具有多向分化潛能的種子細(xì)胞，在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，廣泛用于組織工程和基因工程中[7]。目前，臨床上針對(duì)骨質(zhì)疏松的治療主要有補(bǔ)充維生素D、鈣、體育鍛煉、合理膳食等，但不能有效控制骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。因此，尋找一種有效治療骨質(zhì)疏松的方法具有重大的臨床意義[8]。

microRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于各類生物體中、長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其通過在轉(zhuǎn)錄后水平與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)互補(bǔ)結(jié)合抑制靶基因表達(dá)，能夠參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[9,10]。據(jù)報(bào)道，一些miRNAs可參與骨形成、骨發(fā)育過程，進(jìn)而參與骨相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展[11]。

因此，本文研究miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者中的表達(dá)及其對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化的作用，為進(jìn)一步研究老年骨質(zhì)疏松提供一個(gè)新方向和新思路。

1.資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年1月在山東省青島市市立醫(yī)院接受治療的35例老年骨質(zhì)疏松患者作為研究組，年齡范圍為60～80歲，平均年齡(67.34±10.24)歲，男性17例，女性18例。本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡大于60歲；符合《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南》中對(duì)骨質(zhì)疏松癥的診斷；精神正常；依從性高。本研究排除標(biāo)準(zhǔn)：患有影響骨骼或骨代謝的疾??；服用可能干擾骨骼或骨代謝的藥物，如雌激素、降鈣素、二膦鹽酸等；惡性腫瘤患者；合并有心腦血管嚴(yán)重疾病者；肝、腎功能檢查異常者。此外，我們選取同期在山東省青島市市立醫(yī)院接受體檢的35例骨質(zhì)正常人作為對(duì)照組，并于清晨收集對(duì)照組和研究組患者空腹靜脈血5ml，轉(zhuǎn)速為2000g，室溫離心10分鐘，分離血清樣本，并儲(chǔ)存于超低溫冰箱。健康人血清和老年骨質(zhì)疏松患者血清用于提取血清RNA，并篩選差異性表達(dá)的miRNAs，篩選目的miRNAs后進(jìn)行在細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均自愿參與本課題并簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs及正常人BMSCs均購于中國Procell公司，并用含有10%FBS、間充質(zhì)干細(xì)胞生長添加劑、1%谷氨酰胺、1%雙抗等的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基(Procell，中國)培養(yǎng)BMSCs，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2孵箱(Thermo，美國)中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將BMSCs接種于24孔板(Corning，美國)，轉(zhuǎn)染miRNA，分組分別為miR-590mimic組、mimic-NC組、miR-590 inhibitor組及inhibitor-NC組。采用siPORTTM NeoFXTM轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔中加入20μl無血清培養(yǎng)液+5μl轉(zhuǎn)染試劑，孵育10min；再加入miRNA：miRNA為1.5μl(10μmol/L)+20μl培養(yǎng)基，孵育10min。轉(zhuǎn)染6h后更換含10%血清的培養(yǎng)液，48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 成骨誘導(dǎo) 當(dāng)24孔板中的BMSCs匯合度達(dá)到60%左右時(shí)，將培養(yǎng)液更換為含10% FBS、10mol/L地塞米松、50μg/mL抗壞血酸及10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的成骨誘導(dǎo)液，每3天更換一次誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)21天后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 堿性磷酸酶(ALP)染色 BMSCs成骨誘導(dǎo)21天后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗后，加入ALP染色孵育液，室溫靜置孵育30min后，去離子水洗滌2次，留少量的液體，并置于倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)下觀察，并拍照。

1.6 茜素紅(ARS)染色 BMSCs成骨誘導(dǎo)21天后，用4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS清洗后，加入茜素紅染色液(賽業(yè)，中國)，室溫孵育30min，棄凈染色液，并用PBS清洗3次，置于倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)下觀察，并拍照。

1.7 總RNA的提取與實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 采用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)提取血清和細(xì)胞中總RNA，參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行qRT-PCR檢測。相關(guān)引物序列見表1。

表1 相關(guān)引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均表示為Mean±S.E.M，樣本均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，用Graphpad軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者血清中表達(dá)上調(diào) 收集正常人和老年骨質(zhì)疏松患者血清樣本，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者血清中表達(dá)升高(圖1)。

2.2 miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs中表達(dá)上調(diào) miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者血清中表達(dá)顯著升高，因此，我們繼續(xù)研究miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者和正常人BMSCs中的表達(dá)情況。培養(yǎng)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs和正常BMSCs，檢測miR-590在兩種BMSCs中的表達(dá)情況。如圖2所示，與正常人BMSCs相比，miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs中表達(dá)顯著升高(圖2)。因此，我們猜想老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化能力降低可能與miR-590的表達(dá)升高有關(guān)。

圖1 miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者和正常人血清中的表達(dá)水平

圖2 miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者和正常人BMSCs中的表達(dá)情況

圖3 miR-590mimic對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化的影響。(A)ALP染色；(B)ARS染色；(C)qRT-PCR

圖4 miR-590 inhibitor對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化的影響。(A)ALP染色；(B)ARS染色；(C)qRT-PCR

2.3 老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs的成骨分化能力低于正常BMSCs 為進(jìn)一步研究miR-590對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化的影響，我們繼續(xù)培養(yǎng)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs，并向老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs轉(zhuǎn)染miR-590mimic和mimic-NC，成骨誘導(dǎo)21天后，進(jìn)行ALP染色和ARS染色。ALP染色和ARS染色顯示，過表達(dá)miR-590抑制老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs向成骨方向分化(圖3A和3B)。qRT-PCR顯示，與mimic-NC相比，miR-590mimic顯著降低老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、Runx2和COL-I的表達(dá)(圖3C)。

2.4 敲減miR-590促進(jìn)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs的向成骨方向分化 向老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs轉(zhuǎn)染miR-590 inhibitor和inhibitor-NC，成骨誘導(dǎo)21天后，進(jìn)行ALP染色和ARS染色。ALP染色和ARS染色顯示，miR-590 inhibitor促進(jìn)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs向成骨方向分化(圖4A和4B)。qRT-PCR顯示，與inhibitor-NC相比，miR-590 inhibitor提高老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、Runx2和COL-I的表達(dá)(圖4C)。

3.討論

微小RNA(microRNAs或miRNAs)屬于內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，雖然其含量低，但能夠調(diào)控人類約1/3基因的表達(dá)[12]。近年來研究表明，miRNAs能夠參與骨形成、骨發(fā)育過程，進(jìn)而調(diào)控骨相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展[13]。例如，Cui Q等人發(fā)現(xiàn)敲減miR-185能夠通過調(diào)控BMP/Smad通路，促進(jìn)成骨分化，抑制骨質(zhì)疏松患者骨量流失[14]。miR-103a和miR-660與骨質(zhì)疏松患者骨結(jié)構(gòu)參數(shù)相關(guān)[15]。然而，針對(duì)miRNA與老年骨質(zhì)疏松發(fā)生和發(fā)展的研究并不充分。因此，本文研究miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者中的表達(dá)及其對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化的作用，為臨床治療老年骨質(zhì)疏松提供新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者血清和BMSCs中表達(dá)顯著升高。此外，過表達(dá)miR-590抑制老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs的向成骨方向分化，而敲減miR-590促進(jìn)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs的向成骨方向分化。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了miR-590在老年骨質(zhì)疏松患者中表達(dá)升高，且敲減miR-590能夠逆轉(zhuǎn)老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化能力，miR-590介導(dǎo)的成骨分化可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程中重要的環(huán)節(jié)，但miR-590介導(dǎo)老年骨質(zhì)疏松機(jī)制及治療意義仍需繼續(xù)探究。