竺鑒博，李朝陽，賈鵬禹，李良玉

（1.大慶市薩爾圖區(qū)政府市場監(jiān)督局，黑龍江 大慶 163311；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

0 引言

黑蕓豆在我國具有悠久的種植和食用歷史，中醫(yī)認(rèn)為其具有活血利水、抗衰補(bǔ)血、補(bǔ)血安神、補(bǔ)腎益陰、補(bǔ)肝解毒等功效，經(jīng)現(xiàn)代分析技術(shù)檢測黑蕓豆中含有多種功能性蛋白、多種維生素、大量的不飽和脂肪酸、黃酮苷、花色苷等功能成分[1-2]。目前，對(duì)黑蕓豆的研究主要集中在蕓豆淀粉、黃酮甙、膳食纖維、功能糖、蕓豆蛋白氨基酸等方面[3-9]，在黑蕓豆花色苷方面的研究還很少，而目前國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)表皮顏色較深的黑米、黑豆、紅小豆等作物的表皮進(jìn)行了深入的研究[10-14]，而對(duì)蕓豆中的紅蕓豆、黑蕓豆、花蕓豆等深色種皮蕓豆類花色苷的研究較少。以黑龍江特有蕓豆品種黑蕓豆為原料，進(jìn)行了黑蕓豆花色苷提取工藝的研究，為黑蕓豆綜合利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

黑蕓豆，國家雜糧工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源庫提供；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DR6000型紫外可見光分光光度計(jì)、多頻多功率超聲波處理機(jī)、自制制備色譜柱500×1.5 mm、酸度計(jì)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑蕓豆花色苷的提取工藝

取一定量黑蕓豆，精選除雜處理后粉碎過篩進(jìn)行預(yù)處理，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%鹽酸，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解，超聲輔助提取，料液比1∶10（g∶mL），超聲頻率24 kHz，超聲功率300 W，超聲時(shí)間20 min，超聲溫度30℃，得到黑蕓豆花色苷粗提液[15]。

1.3.2 黑蕓豆花色苷光譜特性的測定

將提取后的黑蕓豆花色苷溶液在波長200～600 nm內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，繪制黑蕓豆花色苷的光譜特征圖，確定最大吸收波長并設(shè)定該波長為測定黑蕓豆花色苷吸光度的λ值。

1.3.3 單因素試驗(yàn)方法[16]

（1） 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響。為研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響，稱取黑蕓豆粉10 g，選擇20%～100%的9個(gè)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為提取劑，料液比1∶20（g∶mL），加入0.1%的鹽酸溶液調(diào)整酸堿度，超聲頻率24 kHz，超聲功率300 W，超聲時(shí)間25 min，超聲溫度30℃，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照黑蕓豆花色苷提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，測定吸光度，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出黑蕓豆花色苷與乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系曲線圖，分析黑蕓豆花色苷吸光度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)變化的規(guī)律。

（2） 超聲溫度對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響。為研究超聲溫度對(duì)提取效果的影響，稱取黑蕓豆粉10 g，70%乙醇為提取劑，選擇20～40℃的5個(gè)不同超聲溫度，料液比1∶20（g∶mL），加入0.1%的鹽酸溶液調(diào)整酸堿度，超聲頻率24 kHz，超聲功率300 W，超聲時(shí)間25 min，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照黑蕓豆花色苷提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，測定吸光度，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出黑蕓豆花色苷與超聲溫度的關(guān)系曲線圖，分析黑蕓豆花色苷吸光度隨著超聲溫度變化的規(guī)律。

（3） 超聲時(shí)間對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響。為研究超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響，稱取黑蕓豆粉10 g，乙醇體積分?jǐn)?shù) 70%為提取劑，選擇10～40 min的7個(gè)不同超聲時(shí)間，料液比1∶20（g∶mL），加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的鹽酸溶液調(diào)整酸堿度，超聲頻率24 kHz，超聲功率300 W，超聲溫度30℃，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照黑蕓豆花色苷提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，測定吸光度，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出黑蕓豆花色苷與超聲時(shí)間的關(guān)系曲線圖，分析黑蕓豆花色苷吸光值隨著超聲時(shí)間變化的規(guī)律。

（4） 超聲功率對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響。為研究超聲功率對(duì)提取效果的影響，稱取黑蕓豆粉10 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%為提取劑，選擇100～500 W的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5個(gè)不同處理功率，料液比1∶20（g∶mL），加入0.1%的鹽酸溶液調(diào)整酸堿度，超聲頻率24 kHz，超聲時(shí)間25 min，超聲溫度30℃，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照黑蕓豆花色苷提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，測定吸光度，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出黑蕓豆花色苷與超聲功率的關(guān)系曲線圖，分析黑蕓豆花色苷吸光度隨著超聲功率變化的規(guī)律。

（5） 料液比對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響。為研究料液比對(duì)提取效果的影響，稱取黑蕓豆粉10 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%為提取劑，選擇1∶5～1∶25（g∶mL） 的 5個(gè)不同處理液料比，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的鹽酸溶液調(diào)整酸堿度，超聲頻率24 kHz，超聲功率300 W，超聲時(shí)間25 min，超聲溫度30℃，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照黑蕓豆花色苷提取的工藝步驟試驗(yàn)，測定吸光度，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出黑蕓豆花色苷與料液比的關(guān)系曲線圖，分析黑蕓豆花色苷吸光度隨著料液比變化的規(guī)律。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方法

在上述研究的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取過程，以黑豆花色苷吸光度為Y，分別設(shè)置超聲功率 （W） 為 X1，超聲溫度 （℃） 為 X2，超聲時(shí)間（ min） 為 X3， 料液比 （ g∶mL） 為 X4。

因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蕓豆花色苷光譜特性的測定結(jié)果

黑蕓豆花色苷的紫外-可見光吸收光譜曲線見圖1。

圖1 黑蕓豆花色苷的紫外-可見光吸收光譜曲線

由圖1可知，在波長520 nm處有最大吸收峰，選擇可見光范圍內(nèi)最大吸收波長520 nm作為吸光度測定波長[17]。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)與黑蕓豆花色苷提取的關(guān)系見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)與黑蕓豆花色苷提取的關(guān)系

由圖2可知，黑蕓豆花色苷的吸光度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加不斷增大；在70%乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)達(dá)到最大之后出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)。這是可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，親水性的糖類和有機(jī)酸等物質(zhì)的溶解能力強(qiáng)，影響了黑蕓豆花色苷的溶出，導(dǎo)致黑蕓豆花色苷得率較低；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%后，浸提液極性過低，一部分極性相對(duì)較強(qiáng)的花色苷不能溶出，導(dǎo)致黑蕓豆花色苷得率較低[18-19]。因此，確定黑蕓豆花色苷提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.2 超聲功率對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響

不同超聲功率與黑蕓豆花色苷提取的關(guān)系見圖3。

圖3 不同超聲功率與黑蕓豆花色苷提取的關(guān)系

由圖3可知，隨著超聲功率的不斷增大，黑蕓豆花色苷的OD值呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；在超聲功率為400 W時(shí)OD值最大，超過400 W后OD值呈下降的趨勢(shì)。這是由于隨著超聲波功率的增加超聲波熱效應(yīng)也增加，可能會(huì)導(dǎo)致黑蕓豆花色苷結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致黑蕓豆花色苷得率的下降[20]。因此，選擇超聲功率300～500 W進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。

2.2.3 超聲溫度對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響

不同超聲溫度與黑蕓豆花色苷提取的關(guān)系見圖4。

圖4 不同超聲溫度與黑蕓豆花色苷提取的關(guān)系

由圖4可知，在30℃時(shí)，OD值達(dá)到最大值，之后不斷下降。隨著超聲溫度的升高，溶劑的溶解能力和溶解速度也隨之提高，溶劑擴(kuò)散率和傳質(zhì)效果增加，黑蕓豆花色苷分子運(yùn)動(dòng)速度也隨之提高，在曲線中表現(xiàn)出來的是溶劑和黑蕓豆花色苷分子在尋求互相融合的速度及能力的平衡過程，最終到達(dá)30℃時(shí)二者到達(dá)最佳平衡狀態(tài)[21]。當(dāng)超聲溫度超過30℃后，吸光度不斷下降，這是由于花色苷自身的熱穩(wěn)定性較差，花色苷類物質(zhì)遇到高熱時(shí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，當(dāng)轉(zhuǎn)化為查爾酮和甲醇假堿，當(dāng)條件恢復(fù)后這個(gè)過程又出現(xiàn)可逆的現(xiàn)象，中間產(chǎn)物一部分還可轉(zhuǎn)變成花色烊陽離子形式[22]。綜合考慮后，選擇30℃為中心點(diǎn)25～35℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響

不同超聲時(shí)間對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響見圖5。

圖5 不同超聲時(shí)間對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響

由圖5可知，超聲時(shí)間在10～20 min時(shí)，吸光度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，20 min時(shí)吸光度最大，20 min后有下降趨勢(shì)并趨于平緩。隨著超聲時(shí)間的增加其熱效應(yīng)及空化作用增強(qiáng)，導(dǎo)致影響了花色苷的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，甚至?xí)?dǎo)致花色苷類物質(zhì)的部分降解，破壞黑蕓豆花色苷結(jié)構(gòu)，影響其吸光度。因此，試驗(yàn)選擇20 min為中心點(diǎn)15～25 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.5 料液比對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響

不同料液比對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響見圖6。

圖6 不同料液比對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響

由圖6可知，在料液比較低時(shí)黑蕓豆花色苷的吸光度隨著料液比的增大不斷升高，溶劑較少時(shí)很快溶解花色苷迅速溶解，擴(kuò)散推動(dòng)力降低，當(dāng)溶劑量足夠大時(shí)，對(duì)超聲波的提取基本無阻礙，OD值逐漸提高；當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g∶mL） 后隨著料液比的增加OD值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，黑蕓豆的成分復(fù)雜，在溶劑充足的情況下其他成分的溶出增多，從而影響了黑蕓豆花色苷的提取[23]。因此，選擇料液比1∶5～1∶15（g∶mL） 進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果與分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲功率（X1），超聲溫度（X2），超聲時(shí)間（X3），料液比（X4）為自變量X，以黑蕓豆花色苷吸光度為Y，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)[24]。

試驗(yàn)安排表和試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)安排表和試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[25]。

回歸方程的方差分析見表3。

由表 3可知，回歸模型p＜0.01，而失擬項(xiàng)的p＞0.05，說明該模型擬和結(jié)果較好。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)p＜0.01，交互項(xiàng)p＜0.05，說明各項(xiàng)均不同程度影響黑蕓豆花色苷的吸光度。

二次回歸模型參數(shù)見表4。

以黑蕓豆花色苷的吸光度為Y值，得出X1超聲功率，X2超聲溫度，X3超聲時(shí)間，X4料液比的X回歸方程為：

表4 二次回歸模型參數(shù)

2.4 交互作用分析

根據(jù)回歸方程的方程分析結(jié)果對(duì)交互作用顯著的交互項(xiàng)進(jìn)行交互作用分析，分析交互作用顯著的兩因素對(duì)黑蕓豆花色苷提取的影響。圖7～圖9是SAS8.2軟件繪出三維曲面及其等高線圖，對(duì)這些因素中交互項(xiàng)之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析[26]。

Y=f（X1，X4）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖7。

圖7 Y=f（X1，X4）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖

由圖7可知，響應(yīng)曲面坡度相對(duì)較大，等高線呈橢圓形，表明X1，X4二者交互作用顯著。由等高線可知，沿X4方向等高線密集，而X1方向等高線相對(duì)稀疏，說明X4相對(duì)于X1對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大。當(dāng) X1在 300～400 W， X4在 1∶5～1∶10（ g∶mL） ，二者存在顯著的增效作用，黑蕓豆花色苷提取率隨2個(gè)因素的增加而增加；當(dāng)X1在400～500 W，X4在1∶10～1∶15（g∶mL），黑蕓豆花色苷提取率隨2個(gè)因素的增加而減小。

Y=f（X2，X3）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖8。

圖8 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖

由圖8可知，響應(yīng)曲面坡度相對(duì)較大，等高線呈橢圓形，表明X2，X3二者交互作用顯著。由等高線可知，沿X3方向等高線密集，而X2方向等高線相對(duì)稀疏，說明X3相對(duì)于X2對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大。當(dāng) X3在 15～20 min， X2在 25～30℃時(shí)， 二者存在顯著的增效作用，黑蕓豆花色苷提取率隨2個(gè)因素的增加而增加；當(dāng) X3在 20～25 min，X2在 30～35℃內(nèi)，黑蕓豆花色苷提取率隨2個(gè)因素的增加而減小。

Y=f（X2，X4）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖9。

由圖9可以看出，響應(yīng)曲面坡度相對(duì)較大，等高線呈橢圓形，表明X2，X4兩者交互作用顯著。由等高線可知，沿X4方向等高線密集，而X2方向等高線相對(duì)稀疏，說明X4相對(duì)于X2，對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大。 當(dāng) X2在 25～30 ℃， X4在 1∶5～1∶10（g∶mL） 內(nèi)，二者存在顯著的增效作用，黑蕓豆花色苷提取率隨 2個(gè)因素的增加而增加；當(dāng)X2在30～35 ℃， X4在 1∶10～1∶15 （g∶mL） ， 黑蕓豆花色苷提取率隨2個(gè)因素的增加而減小。

2.5 最優(yōu)條件確定

為了進(jìn)一步確證最佳點(diǎn)的值，采用SAS軟件的Rsreg語句對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行響應(yīng)面典型分析，以獲得最大提取效果時(shí)的條件。

圖9 Y=f（X2，X4）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖

最優(yōu)提取條件及吸光度見表5。

表5 最優(yōu)提取條件及吸光度

提取效果最高時(shí)的超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比的具體值分別為420 W，29℃，18.7 min，1∶13（g∶mL），該條件下得到的最大吸光度為0.47。驗(yàn)證試驗(yàn)得到黑蕓豆花色苷的最大吸光度為0.47±0.05，與理論值非常接近，可以看出建立的模型能夠較好地反映出超聲波輔助提取黑蕓豆花色苷的條件。

3 結(jié)論

經(jīng)過試驗(yàn)得到黑蕓豆花色苷的最佳提取工藝參數(shù)為超聲功率420 W，超聲溫度29℃，超聲時(shí)間18.7 min，料液比1∶13（g∶mL），經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，黑蕓豆花色苷的最大吸光度為0.47±0.05。提高了黑蕓豆花色苷的提取效率，降低了花色苷提取的成本，同時(shí)增加了黑蕓豆加工的附加值，促進(jìn)我國黑蕓豆生產(chǎn)、加工等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。