王 成 李月明 郝 楠 白 添

（1 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，沈陽110161；2 遼寧省東北育才超常教育實(shí)驗(yàn)部，沈陽110161）

玉米是溫度敏感性作物，在種子吸脹期間如遇低溫，極易發(fā)生吸脹冷害，造成后期成苗率顯著下降，使玉米大幅減產(chǎn)[1]。當(dāng)植物遭遇低溫脅迫時，細(xì)胞內(nèi)會積累大量的氧自由基，細(xì)胞膜透性增大，造成氧化脅迫傷害[2]。多胺被認(rèn)為是植物體內(nèi)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，是一類具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿的總稱，最常見的包括精胺（Spm，spermine）、亞精胺（Spd，spermidine）和腐胺（Put，putrescine），具有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫尤其是減少氧化脅迫傷害等作用[3-6]。Kamiab 等[7]研究表明，當(dāng)植物幼苗遭遇鹽脅迫時外源施加多胺能有效提高其抗性；當(dāng)植物遭遇水脅迫時，生長發(fā)育會明顯受到抑制，而Duan 等[8]的研究結(jié)果顯示外源施加多胺能有效緩解水脅迫抑制作用。在玉米中的研究表明，葉面噴施外源多胺能顯著提高夏玉米灌漿前期抗?jié)承訹9]；當(dāng)玉米幼苗遭受鎘（Cd，Cadmium）脅迫時，多胺也能顯著促進(jìn)幼苗的生長，降低脅迫傷害[10]；崔寶明[11]研究認(rèn)為外源多胺可在一定程度上促進(jìn)玉米幼苗的再生，增加株高、葉長、葉寬、鮮重，并提高其根系活力。

種子的萌發(fā)是由種子活力和外界環(huán)境因素共同決定的，而非生物脅迫是限制種子萌發(fā)的重要因素。引發(fā)劑是一類化學(xué)物質(zhì)，而通過種子引發(fā)等化學(xué)調(diào)控方法能有效增強(qiáng)植物溫度逆境耐性[12]。目前關(guān)于低溫對玉米種子萌發(fā)的研究較多，但大多集中在對發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)等形態(tài)指標(biāo)的研究上，而對外源引發(fā)劑施用對玉米種胚生理生化和萌發(fā)特性調(diào)控機(jī)制的研究較少?；诖?，本研究以對低溫敏感性不同的遼寧地區(qū)骨干自交系為研究材料，研究在低溫脅迫下，外源施加Spm 和Spd 對玉米種子萌發(fā)、苗期生長和抗氧化酶活性等指標(biāo)的影響，分析多胺施用與低溫脅迫之間的關(guān)系，探討利用外源多胺緩解玉米種子低溫脅迫的相關(guān)機(jī)制，以期為種子引發(fā)技術(shù)在玉米生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料為本實(shí)驗(yàn)室前期篩選的玉米耐冷自交系遼2386 和冷敏感自交系遼6082。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，4 次重復(fù)。

1.2.1 種子引發(fā)處理 在墊有兩層濾紙發(fā)芽盒中均勻排列50 粒玉米種子，加入Spm（0.25mmol/L）、Spd（0.25mmol/L）溶液各10mL 和NaClO（0.3%）溶液1mL，在15℃黑暗條件下引發(fā)72h。引發(fā)結(jié)束后，將種子用蒸餾水快速沖洗3 次，吸干表面水分，于25℃陰涼通風(fēng)處放置3d。對照為經(jīng)NaClO （0.3%）溶液消毒10min 而未引發(fā)的種子。

1.2.2 種子低溫吸脹發(fā)芽 采用人工模擬低溫的試驗(yàn)，將2 個玉米自交系種子在5℃黑暗條件下蒸餾水低溫吸脹48h 后，按照GB/T3543.4-1995 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)規(guī)程[13]，采用沙盤培養(yǎng)法在25℃（光照12h/d）的恒溫培養(yǎng)箱（三洋MLR-351H）進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

1.3 測定項目與方法 調(diào)查發(fā)芽7d 后玉米種子的發(fā)芽數(shù)，并計算發(fā)芽率，測定苗長、根長、苗鮮重、根鮮重、苗干重和根干重等性狀指標(biāo)。

發(fā)芽率=發(fā)芽試驗(yàn)?zāi)┢谝?guī)定日期內(nèi)正常的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

玉米種子在5℃低溫黑暗條件下分別吸脹0h、12h、24h、36h 和48h 后，手工剝離種胚，測定丙二醛（MDA）含量和過氧化歧化酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，3 次重復(fù)。MDA 含量測定采用硫代巴比妥（TBA）顯色反應(yīng)法，POD 活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，SOD 活性測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法，具體參照張蜀秋[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010 和SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多胺引發(fā)對玉米種子發(fā)芽和苗期生物量的影響 耐冷自交系遼2386 低溫吸脹后發(fā)芽率為90%，冷敏感自交系遼6082 低溫吸脹后發(fā)芽率僅為83%。種子經(jīng)多胺引發(fā)后，遼2386 的發(fā)芽率為91%，和引發(fā)前差異不顯著，而遼6082 發(fā)芽率為93%，和引發(fā)前相比顯著提高了12%（圖1A）。玉米苗期生物量測定結(jié)果顯示：種子經(jīng)多胺引發(fā)后，不同自交系苗期表型差異較大（圖1B）。遼2386 苗高和根長分別為6.88±1.13cm 和10.06±1.04cm，和未引發(fā)種子相比，苗高差異不顯著，而根長顯著降低了29.08%；遼6082 苗高和根長分別為9.28±0.37cm和10.07±0.26cm，和未引發(fā)種子相比，根長差異不顯著，而苗高顯著提高了44.62%（圖1C 和D）。對苗鮮重、根鮮重、苗干重和根干重等指標(biāo)進(jìn)行分析，遼6082 種子經(jīng)多胺引發(fā)后苗鮮重顯著提高了26.76%（圖1E），其他指標(biāo)差異不顯著（圖1F～H）。結(jié)果表明，玉米不同自交系及不同器官對多胺敏感性不同，施加該濃度的多胺引發(fā)劑對低溫條件下冷敏感自交系種子生長和發(fā)育具有很好的促進(jìn)作用。

2.2 低溫吸脹期玉米胚中MDA 含量和抗氧化酶活性的變化 對胚中MDA 含量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著5℃低溫吸脹時間的延長，遼2386 多胺引發(fā)前后胚中的MDA 含量大體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，而遼6082 大體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。未經(jīng)引發(fā)處理的遼6082 種胚中的MDA 含量在0h、12h、24h 和48h 4 個吸脹時期均高于遼2386，并分別在24h 和36h 先后達(dá)到峰值。兩自交系種子經(jīng)多胺引發(fā)后，胚中MDA 含量均顯著降低，且遼6082 在大部分吸脹時期均高于遼2386（圖2A）。

圖1 多胺引發(fā)對玉米種子低溫吸脹后發(fā)芽率和苗期生物量的影響

對胚中SOD 活性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著5℃低溫吸脹時間的延長，遼2386 和遼6082 多胺引發(fā)前后胚中的SOD 活性大體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。遼2386 未經(jīng)引發(fā)處理的胚中SOD 活性高于遼6082。經(jīng)多胺引發(fā)后，遼2386 胚中SOD 活性在吸脹前期顯著升高且在12h 達(dá)到高峰后又逐漸下降，而遼6082 胚中SOD 活性在大部分吸脹時期均顯著升高，且在36h 達(dá)到高峰（圖2B）。

對胚中POD 活性進(jìn)行分析結(jié)果顯示，隨著5℃低溫吸脹時間的延長，POD 活性大體上呈現(xiàn)下降趨勢，未經(jīng)引發(fā)處理的遼2386 胚中的POD 活性在大部分吸脹時期均高于遼6082，經(jīng)多胺引發(fā)后，POD活性均顯著提高，遼6082 提高幅度更大且在36h 達(dá)到高峰（圖2C）。

圖2 低溫吸脹下胚中MDA 含量以及SOD 和POD 活性

3 結(jié)論與討論

吸脹冷害是指種子在低溫下進(jìn)行吸脹產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致種子活力下降，影響種子的田間出苗率和幼苗的正常生長發(fā)育[15]。玉米種子萌發(fā)的最適溫度一般是24～31℃，低溫對種子活力指標(biāo)有顯著的抑制作用。不同的玉米自交系對溫度敏感性差異較大，在本試驗(yàn)中，種子在5℃黑暗條件下低溫吸脹48h后，冷敏感自交系遼6082 發(fā)芽率顯著低于遼2386，在種子吸脹中的低溫脅迫期，從MDA 含量和POD、SOD 的活性測定分析結(jié)果中也可以看出，遼2386的膜脂過氧化程度較輕，而對氧自由基的清除能力和對低溫逆境的適應(yīng)性強(qiáng)于遼6082。說明不同基因型玉米對低溫的耐受性存在顯著差異，這與前人研究結(jié)果[16]相一致。

目前，對冷害機(jī)制研究較多，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為冷害對植物的傷害主要表現(xiàn)為膜損傷而引起的內(nèi)部代謝紊亂。正常情況下，生物膜保持一定的流動性，當(dāng)遭遇冷害時，冷敏感植物的膜緊密收縮，使膜透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)外滲，同時酶系統(tǒng)遭受破壞，酶活性降低，嚴(yán)重時發(fā)生冷害死亡。而一些植物的膜系統(tǒng)修復(fù)能力較強(qiáng)，同時能夠及時清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，提高低溫逆境的適應(yīng)性[17]。MDA 為膜脂過氧化過程中，活性氧攻擊細(xì)胞膜上的膜脂而產(chǎn)生，因此MDA 含量是逆境生理研究中的一個標(biāo)志膜脂過氧化程度的重要生理指標(biāo)，而POD 和SOD 能夠通過化學(xué)反應(yīng)清除植物體內(nèi)的氧自由基，保護(hù)植物細(xì)胞。一般認(rèn)為，植物內(nèi)部的POD、SOD 活性與種子對低溫逆境的適應(yīng)性呈正相關(guān)，而MDA 含量與種子對低溫逆境的適應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)[18]，這與本研究所得結(jié)果相一致。

種子引發(fā)技術(shù)已被應(yīng)用到不同植物種子生產(chǎn)實(shí)踐中，引發(fā)后的種子出苗率高且整齊，苗期抗逆性好[19-21]，但國內(nèi)玉米種子引發(fā)劑篩選研究較少。左冰云等[22]研究表明以外源赤霉素（GA）作為引發(fā)劑對玉米種子進(jìn)行處理可顯著提高玉米葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、單株葉面積、干物質(zhì)積累量、光合色素含量以及百粒重和籽粒產(chǎn)量。王莉等[23]以GA 和KCl 作為引發(fā)劑對玉米種子進(jìn)行處理，結(jié)果表明引發(fā)劑可不同程度增強(qiáng)種子活力、提高發(fā)芽質(zhì)量以及增強(qiáng)耐鹽性。杜錦等[24]研究表明玉米種子經(jīng)NaCl 溶液引發(fā)處理后，出苗率和苗期生物量均顯著增加。以上研究篩選出了多種適宜玉米種子萌發(fā)的引發(fā)劑，為引發(fā)劑在玉米種子生產(chǎn)應(yīng)用中奠定了基礎(chǔ)。而多胺作為引發(fā)劑的研究較少，張彥萍[25]研究結(jié)果證明多胺引發(fā)能夠提高茄子種子活力及幼苗抗冷性。本研究主要是以低溫敏感性不同的玉米作為材料，研究結(jié)果表明多胺引發(fā)劑Spd 和Spm 引發(fā)能有效提高吸脹中低溫脅迫下種子的抗氧化能力和發(fā)芽能力，結(jié)合前人研究結(jié)果推測，多胺能夠提高植物抗冷性的可能原因主要是多胺是一類具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，可以以多聚陽離子的方式存在，同時可以結(jié)合帶負(fù)電荷的核酸以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，從而激活一系列表達(dá)調(diào)控反應(yīng)，調(diào)節(jié)抗氧化酶SOD 和POD 等活性，從而使植物產(chǎn)生抗冷性[26-27]。因此，外源多胺引發(fā)處理這項技術(shù)的應(yīng)用將對提高早春低溫播種條件下玉米出苗率和成苗率具有重要的意義。