王羅云，何彩云，羅紅梅，張建國，段愛國，曾艷飛

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所 國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100091；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古 磴口015200）

沙棘Hippophae rhamnoides別名醋柳、沙棗，為胡頹子科Elaeagnaceae沙棘屬Hippophae多年生落葉灌木或小喬木。根據(jù)SUN等［1］和BARTISH等［2］的系統(tǒng)分類，沙棘屬共有7個(gè)種，11個(gè)亞種；其中有9個(gè)亞種廣泛分布于亞歐溫帶地區(qū)。沙棘果實(shí)中維生素C和黃酮含量較高，種子中富含脂肪油，枝葉富含高蛋白，這些生物活性物質(zhì)是美容產(chǎn)品、抗敗血酸藥物和營養(yǎng)補(bǔ)充劑等的重要組成成分［3］；沙棘的根系能產(chǎn)生根瘤，具有固氮功能，從而可達(dá)到改善土壤的作用；又由于其能適應(yīng)干旱的環(huán)境，可以防風(fēng)固沙，因此可用于生態(tài)恢復(fù)和土壤保護(hù)。因此沙棘是集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益為一體的多用途樹種［3-4］。中國是沙棘屬植物類群分布最多的國家，包括7個(gè)種，5個(gè)亞種；其沙棘屬的資源蘊(yùn)藏量也最大，沙棘天然林分布達(dá)67.54萬hm2［4］；而中國的青藏高原地區(qū)被認(rèn)為是沙棘的起源中心［5］。目前，中國沙棘種植總面積達(dá)200.00萬hm2，約占世界總面積的90%以上［6］。但當(dāng)前廣泛用于栽培的大果沙棘品種主要是從俄羅斯引進(jìn)的，人工選育自蒙古沙棘H.rhamnoidessubsp.mongolica亞種的天然遠(yuǎn)緣雜交種［7］。中國沙棘自然資源的開發(fā)和利用對(duì)其人工培育有重要意義；而對(duì)沙棘遺傳多樣性的系統(tǒng)研究是沙棘新品種選育的基礎(chǔ)之一。目前，已有利用分子標(biāo)記研究沙棘屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的報(bào)道［1，8］，探討了沙棘種下不同亞種的起源過程［5］，分析了沙棘個(gè)別亞種，如中國沙棘H.rhamnoidessubsp.sinensis，云南沙棘H.rhamnoidessubsp.yunnanensis的遺傳多樣性，但是對(duì)于沙棘種下多個(gè)亞種的多樣性及分化的研究很少。本研究利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）標(biāo)記比較分析了沙棘中分布最廣的7個(gè)亞種的遺傳多樣性和遺傳分化，分析了當(dāng)前廣泛栽培的26個(gè)大果沙棘品種的遺傳多樣性和可能來源，以期為沙棘新品種選育提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 分析材料和DNA提取

從野外采集中國沙棘，云南沙棘，中亞沙棘H.rhamnoidessubsp.turkestanica，蒙古沙棘，高加索沙棘H.rhamnoidessubsp.caucasica，海濱沙棘H.rhamnoidessubsp.rhamnoides和溪生沙棘H.rhamnoidessubsp.fluviatilis共7個(gè)沙棘亞種葉片樣品，其中：蒙古沙棘20個(gè)個(gè)體，其他沙棘亞種各10個(gè)個(gè)體；收集在中國林業(yè)科學(xué)研究院溫室播種的高加索沙棘幼苗10株；從黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所、中國林業(yè)科學(xué)研究院沙漠實(shí)驗(yàn)中心收集26個(gè)大果沙棘品種的葉片。樣品采集見表1。葉片采集后用變色硅膠干燥處理帶回實(shí)驗(yàn)室，采用植物全基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物公司）提取總DNA。

表1 7個(gè)沙棘亞種與26個(gè)大果沙棘品種采樣信息Table 1 Sampling information of the 7 subspecies and 26 cultivars of Hippophae rhamnoides

1.2 微衛(wèi)星標(biāo)記分析

所用的14個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記選自李珊珊等［9］從沙棘轉(zhuǎn)錄組和基因組中開發(fā)的，引物信息見表2。為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，PCR擴(kuò)增采用將2～4對(duì)攜帶不同熒光標(biāo)記（Fam，Hex，Rox和Tamra，生工生物工程股份有限公司，上海），且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度不同的微衛(wèi)星引物混合后，在同一PCR管中進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)體系為30 μL，分別包括2×T5 Super PCR Mix（PAGE）（擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，北京），正向和反向引物分別0.2 μmol·L-1和模板 DNA約 50 ng。熱循環(huán)反應(yīng)在 ABI System 9700PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems，Life Technologies）上進(jìn)行，程序如下：94℃預(yù)變性4 min，10個(gè)循環(huán)的94℃變性30 s，60℃（每個(gè)循環(huán)降1℃）退火30 s和72℃延伸45 s，20個(gè)循環(huán)的94℃變性30 s，50℃退火30 s和72℃延伸45 s，最后72℃10 min。

PCR產(chǎn)物交由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行變性［0.5 μL產(chǎn)物與9.0 μL的甲酰胺，0.5 μL的內(nèi)標(biāo)Liz500（Applied Biosystems，Life Technologies）混合后93℃變性5 min］，然后在ABI 3730測(cè)序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。最后利用Genemapper 4.0軟件（Applied Biosystems，Life Technologies）讀取電泳結(jié)果并分析得到每個(gè)個(gè)體基因型。每一批數(shù)據(jù)從PCR到毛細(xì)管電泳，都以大果沙棘品種 ‘向陽’為陽性對(duì)照。

1.3 遺傳多樣性和分化分析

采用軟件GenALEX 6.503［10］，針對(duì)每個(gè)沙棘亞種和所有品種，計(jì)算如下遺傳多樣性指數(shù)：等位基因個(gè)數(shù)（NA）， 有效等位基因個(gè)數(shù)（Ne）， Shannon 信息指數(shù)（I）， 觀測(cè)雜合度（HO）， 期望雜合度（HE）和固定指數(shù)（F）。 利用微衛(wèi)星分析軟件 MSA 4.05［11］計(jì)算亞種兩兩之間的遺傳分化系數(shù)（FST）［12］， 并進(jìn)行 10 000次重抽樣后統(tǒng)計(jì)顯著性，檢驗(yàn)各亞種間分化是否顯著偏離于0。

表2 14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)基本信息Table 2 Information of the 14 microsatellite loci

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于個(gè)體多位點(diǎn)微衛(wèi)星基因型，利用MSA軟件［11］計(jì)算個(gè)體之間的遺傳距離（DC）［13］；然后基于此遺傳距離，采用PHYLIP 3.695［14］軟件包中的NEIGHBOR子程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值設(shè)為500次。

1.5 貝葉斯聚類

利用貝葉斯聚類軟件STRUCTURE 2.3.4［15］確定沙棘各亞種的分組，并鑒定大果沙棘品種的來源。分析采用混合模型（admixture model），考慮各亞種的等位基因頻率相關(guān)（allele frequencies correlated），分組數(shù)K值設(shè)置為1～10，每個(gè)K值重復(fù)計(jì)算10次，每次的運(yùn)算進(jìn)行1 000 000次迭代和100 000次BURNIN。利用Structure Harvester［16］計(jì)算STRUCTURE運(yùn)算結(jié)果中各K值所對(duì)應(yīng)的似然值lnP（D）與模型值ΔK，根據(jù)lnP（D）和ΔK最大的原則［17］選擇合適的分組數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘亞種與品種的14個(gè)SSR位點(diǎn)及種間關(guān)系分析

沙棘7個(gè)亞種的14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)平均NA為2.643～4.643，NE為1.869～3.065，I為0.559～1.053，HO為2.460～0.477，HE為0.293～0.523，F(xiàn)為0.002～0.300。其中：中國沙棘的遺傳多樣性為所有沙棘亞種中最高，有著最高的NE，I，HO和HE（表3），其次為云南沙棘，但云南沙棘的F遠(yuǎn)高于中國沙棘，顯示云南沙棘個(gè)體間差異較大。高加索沙棘的NE，I，HE和F在所有沙棘亞種中最低，表明其遺傳多樣性水平最低，次低為海濱沙棘?？傮w來看，亞洲分布的中國沙棘、云南沙棘、蒙古沙棘和中亞沙棘遺傳多樣性普遍高于歐洲分布的溪生沙棘、海濱沙棘和高加索沙棘。26個(gè)大果沙棘品種的等位基因個(gè)數(shù)最多，可能與其個(gè)體數(shù)最多有關(guān)，但是其NE，I，HO，HE與各沙棘亞種的值相比都屬于中等。

沙棘亞種兩兩之間的FST都顯著大于0（表4），表明各亞種間分化明顯。其中：蒙古沙棘和中亞沙棘之間分化最低（FST=0.274），次低為中國沙棘和云南沙棘之間（FST=0.283）；中國沙棘和高加索沙棘之間遺傳分化最高（FST=0.535）。亞洲分布的沙棘亞種與歐洲分布的沙棘亞種之間分化普遍高于這2個(gè)地區(qū)內(nèi)部亞種之間的分化。

2.2 沙棘亞種與品種的系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示：除大果沙棘品種外，所有沙棘個(gè)體分成7個(gè)分支，與亞種分類基本一致。僅1個(gè)中亞沙棘個(gè)體列到亞種分支以外，但各分支的支持率并不高。這7個(gè)分支可以分成2個(gè)大支：歐洲分布的高加索沙棘、溪生沙棘和海濱沙棘以77.6%的支持率聚為一大支；亞洲分布的中國沙棘、云南沙棘、中亞沙棘和蒙古沙棘聚為另一大支（圖1）。大果沙棘品種主要分成2個(gè)大支：大部分的品種個(gè)體聚成一支，然后與蒙古沙棘亞種野生個(gè)體分支聚在一起；另有5個(gè)品種（‘新俄2’ ‘Xine No.2’， ‘芬蘭’‘Fenlan’， ‘首都’ ‘Shoudu’， ‘小辣椒’ ‘Xiaolajiao’， ‘深秋紅’ ‘Shenqiuhong’） 以超過 50%的支持率聚為一支，位于歐洲分布的沙棘亞種分支和亞洲分布的沙棘亞種分支之間。大果沙棘品種‘中俄雜4’ ‘Zhongeza No.4’位于中國沙棘和云南沙棘分支的基部。

表3 7個(gè)沙棘亞種與26個(gè)沙棘品種的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of the 7 subspecies and 26 cultivars of Hippophae rhamnoides

表4 基于14個(gè)SSR位點(diǎn)的沙棘亞種間遺傳分化系數(shù)Table 4 Subspecies pairwise FST based on 14 SSR loci

圖1 7個(gè)沙棘亞種和26個(gè)沙棘品種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹Figure 1 Phylogenetic tree of the 7 subspecies and 26 cultivars of Hippophae rhamnoides

2.3 沙棘亞種與品種的貝葉斯聚類分析

貝葉斯聚類分析發(fā)現(xiàn)：當(dāng)K=7時(shí)，lnP（D）迅速增加；當(dāng)K＞7時(shí)lnP（D）的增加趨于緩慢。可見，K=7是一個(gè)明顯的拐點(diǎn)（圖2A）。因此，lnP（K）支持所有的沙棘亞種和品種分為7組。而從ΔK與K的關(guān)系可以看出：在K=3處，ΔK有1個(gè)顯著的峰值（圖2B），因而支持所有沙棘個(gè)體劃分為3組。第1組由中國沙棘和云南沙棘組成，第2組主要由蒙古沙棘和大部分大果沙棘品種組成，第3組由溪生沙棘、高加索沙棘和海濱沙棘組成。中亞沙棘的遺傳成分主要來源于第2組，并包含少量的第3組和更少的第1組遺傳成分。大果沙棘品種 ‘新俄2’ ‘芬蘭’ ‘首都’ ‘小辣椒’和 ‘深秋紅’的遺傳組成中第2組和第3組各約占50%；大果沙棘品種 ‘巨人’ ‘Juren’的遺傳組成主要來自第2組，第3組約占20%；大果沙棘 ‘中俄雜4’的遺傳組成中第1組和第2組各約占50%。當(dāng)所有個(gè)體劃分為7組時(shí)，中國沙棘、云南沙棘、中亞沙棘、蒙古沙棘、溪生沙棘、高加索沙棘和大部分大果沙棘品種各自組成一組，但云南沙棘包含少量其他各組的成分，中亞沙棘和蒙古沙棘包含大果沙棘組的成分，溪生沙棘包含高加索沙棘和云南沙棘的遺傳成分；海濱沙棘由溪生沙棘和高加索沙棘的遺傳成分共同構(gòu)成，大果沙棘品種 ‘新俄2’ ‘芬蘭’ ‘首都’ ‘小辣椒’和 ‘深秋紅’的遺傳成分一半來自大果沙棘組，另一半由溪生沙棘和高加索沙棘組共同構(gòu)成，大果沙棘 ‘中俄雜4’則中國沙棘和大果沙棘組各約占50%。

圖2 7個(gè)沙棘亞種和26個(gè)沙棘品種Structure聚類分析Figure 2 Structure cluster analysis of the 7 subspecies and 26 cultivars of Hippophae rhamnoides

3 討論

3.1 沙棘亞種的分化及親緣關(guān)系

廉永善等［18］根據(jù)形態(tài)特征分析認(rèn)為：沙棘種下的9個(gè)亞種可歸為3組：中國沙棘、云南沙棘和臥龍沙棘H.rhamnoidessubsp.wolongensis分為第1組；蒙古沙棘、高加索沙棘和中亞沙棘為第2組；喀爾巴千山沙棘H.rhamnoidessubsp.carpatica，海濱沙棘和溪生沙棘為第3組。馬玉花等［8］基于ITS序列建立的系統(tǒng)樹認(rèn)為沙棘9個(gè)亞種分為2個(gè)組：高加索沙棘、海濱沙棘、喀爾巴千山沙棘、中亞沙棘、云南沙棘和臥龍沙棘為一組；蒙古沙棘、溪生沙棘與中國沙棘為另一組。本研究基于14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出：7個(gè)沙棘亞種主要分成2個(gè)組：歐洲分布的海濱沙棘、溪生沙棘和高加索沙棘為一組；亞洲分布的中國沙棘、云南沙棘、蒙古沙棘和中亞沙棘為另一組。組間不同亞種之間的遺傳分化系數(shù)也明顯高于組內(nèi)不同亞種間。這說明跨歐亞大陸的地理隔離已造成歐洲和亞洲分布的沙棘亞種之間更為明顯的分化。貝葉斯分析顯示：這7個(gè)沙棘亞種可分為3個(gè)組：中國沙棘和云南沙棘分為第1組；蒙古沙棘和中亞沙棘為第2組；海濱沙棘、溪生沙棘和高加索沙棘為第3組。該分組結(jié)果與廉永善等［18］根據(jù)形態(tài)特征的分組更為相近，只是在高加索沙棘的歸屬上稍有差別。高加索沙棘可能在歐洲分布的時(shí)間較短，導(dǎo)致高加索沙棘與溪生沙棘、海濱沙棘的基因交流更廣泛，但在形態(tài)學(xué)上，高加索沙棘還未能從蒙古沙棘和中亞沙棘區(qū)分開。

本研究還發(fā)現(xiàn)：在系統(tǒng)發(fā)育樹中，沙棘個(gè)體大都按亞種聚類，即來自同一亞種的個(gè)體聚為一支；在貝葉斯聚類分析中，當(dāng)分7組時(shí)，除海濱沙棘由溪生沙棘組和高加索沙棘組共同構(gòu)成外，其他亞種都各自分成一組。這說明沙棘各亞種間存在明顯的遺傳分化，與兩兩沙棘亞種間較高的遺傳分化系數(shù)相符。基因交流的限制［19］和對(duì)各自生境的適應(yīng)性進(jìn)化都可能造成沙棘亞種間明顯的遺傳分化。然而，貝葉斯聚類分析顯示：各沙棘亞種間可能存在少量的雜交和基因漸滲；系統(tǒng)發(fā)育樹中每個(gè)亞種的分支支持率并不高，也說明種間雜交可能存在。這與JIA等［5］利用cpDNA片段以及ITS序列對(duì)沙棘種下9個(gè)亞種的分析結(jié)果一致。然而，要進(jìn)一步確認(rèn)各亞種間雜交和基因漸滲的方向和程度，還需要更多樣品和基因組范圍內(nèi)更多位點(diǎn)的詳細(xì)分析。

3.2 沙棘亞種的遺傳多樣性比較

JIA等［5］推測(cè)沙棘主要起源于中國青藏高原地區(qū)，中國東部和歐洲分布的沙棘亞種都是從該地區(qū)擴(kuò)散而來。本研究發(fā)現(xiàn)：中國分布的中國沙棘和云南沙棘的遺傳多樣性水平遠(yuǎn)高于歐洲分布的溪生沙棘、高加索沙棘和海濱沙棘，這與沙棘起源于中國青藏高原地區(qū)的假說相符。相比分布廣泛的中國沙棘，云南沙棘僅分布在西藏、四川、青海和云南交界的狹長(zhǎng)地帶，分布范圍較小，較高的遺傳多樣性可能與其分布鄰近起源中心有關(guān)。云南沙棘分布區(qū)地形復(fù)雜，環(huán)境變化多端，因此，該亞種各個(gè)體也可能因適應(yīng)不同的環(huán)境而積累了較高的遺傳變異［19］。云南沙棘有著最高的固定指數(shù)F，也說明其個(gè)體間遺傳變異較大。

分析樣品的數(shù)量和采集方式也可能會(huì)影響沙棘亞種遺傳多樣性的評(píng)估。在本研究中，除蒙古沙棘為20個(gè)個(gè)體外，其他沙棘均為10個(gè)個(gè)體。因此當(dāng)亞種間進(jìn)行比較時(shí)，不存在樣品數(shù)量的偏差。另外，除高加索沙棘取自種子的播種苗外，其他沙棘亞種的個(gè)體都采自2～4個(gè)野外種群，這也將減小地理種群的偏差。當(dāng)然，要準(zhǔn)確評(píng)估沙棘各亞種內(nèi)的遺傳多樣性水平，還需整個(gè)分布區(qū)更全面的采樣。

3.3 大果沙棘品種的來源和多樣性比較

基于14個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星基因型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，大部分大果沙棘品種都和采自中國新疆阿勒泰地區(qū)的蒙古沙棘亞種聚在一起；貝葉斯聚類分析將所有沙棘個(gè)體劃分為3組時(shí)（K=3），大果沙棘品種也和蒙古沙棘亞種為一組，這與大果沙棘人工選育自蒙古沙棘亞種的記錄相符。然而，系統(tǒng)發(fā)育樹和貝葉斯聚類分析都能將大果沙棘品種和中國新疆阿勒泰地區(qū)的蒙古沙棘個(gè)體分開，說明用來品種選育的俄羅斯蒙古沙棘種群與中國新疆阿勒泰地區(qū)的蒙古沙棘種群存在明顯的遺傳分化。系統(tǒng)發(fā)育樹和貝葉斯聚類分析表明：本研究所分析的大果沙棘品種并非都選育自蒙古沙棘亞種，品種 ‘新俄2’ ‘芬蘭’ ‘首都’ ‘小辣椒’和 ‘深秋紅’可能是蒙古沙棘和歐洲分布的沙棘亞種雜交的結(jié)果。

本研究還發(fā)現(xiàn)：所收集的26個(gè)大果沙棘品種多樣性稍高于中國新疆阿勒泰地區(qū)的蒙古沙棘亞種野生種群，與本研究的7個(gè)沙棘亞種相比屬于中等偏上水平，表明用于栽培的大果沙棘品種具有豐富的遺傳變異。劉雨娜等［20］曾利用RAPD標(biāo)記分析了24個(gè)大果沙棘品種得出同樣的結(jié)論。大果沙棘品種來源于蒙古沙棘的遠(yuǎn)緣雜交后代，這自然會(huì)提高大果沙棘的多樣性水平；其次，本研究表明：少量大果沙棘品種具有歐洲分布的其他沙棘亞種的遺傳成分，說明這些沙棘可能是蒙古沙棘和歐洲其他沙棘種雜交的結(jié)果，這也提高了大果沙棘的多樣性水平。雖然大果沙棘品種有著豐富的遺傳變異，但其多樣性仍低于從野外采集的少量中國沙棘和云南沙棘個(gè)體。這說明，中國豐富的沙棘自然資源可為沙棘新品種的選育提供重要的遺傳基礎(chǔ)。