(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

豬圓環(huán)病毒2型(Porce circovirus type 2，PCV2)為圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬的成員，是1種無(wú)囊膜單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，為已知的最小的動(dòng)物病毒之一[1]。PCV2首先由Tischer于1974年在PK-15豬腎傳代細(xì)胞系中分離獲得，該病毒長(zhǎng)期持續(xù)感染PK-15細(xì)胞，但不引起細(xì)胞病變(CPE)。PCV2具有致病性，與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)密切相關(guān)，主要侵害6～12周齡斷奶仔豬，以漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難急促和多系統(tǒng)病理?yè)p傷為主要特征，導(dǎo)致機(jī)體的免疫力低下或喪失，進(jìn)而易引起其他病原的繼發(fā)感染或混合感染[2]。20世紀(jì)90年代，PCV2感染作為PMWS病因在加拿大被報(bào)道后，世界很多國(guó)家證實(shí)有PCV2的存在和流行；我國(guó)自2000年發(fā)現(xiàn)豬群中存在PCV2感染以來(lái)，由PCV2感染所致的疾病被不斷報(bào)道，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[3]。PCV2基因組全長(zhǎng)1 767 bp 或1 768 bp[4]。PCV2可分為 5個(gè)基因型：PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d、PCV-2e，有學(xué)者從無(wú)PMWS癥狀豬和有明顯PMWS癥狀豬中均分離到了PCV-2，說(shuō)明不同型PCV-2之間的毒力不同[5]。本研究對(duì)PCR檢測(cè)PCV2為陽(yáng)性的病料進(jìn)行PCV2全基因組的克隆及序列分析，確定分離株的基因型，為貴州地區(qū)豬群中PCV2的基因分型及其變異情況提供參考，為進(jìn)一步豐富貴州PCV2的分子流行病學(xué)和有效控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)自貴州省遵義、福泉、金沙、榕江、赫章等地區(qū)發(fā)病豬的組織及血樣病料20份。

1.2 主要試劑PCR試劑(包括rTaq酶、dNTPs、10×PCR buffer等)、DL 2 000 Marker、pMD19-T Vector、HindⅢ、BamHⅠ 內(nèi)切酶、DNA膠回收試劑、DNA/RNA Extraction Kit Ver.5.0、氨芐青霉素(Amp)、大腸桿菌DH5α等，均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 病料中PCV2的檢測(cè)將病料研磨后液氮反復(fù)凍融3次，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液；血樣直接離心取血清。用TaKaRa MinBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒提取核酸，利用實(shí)驗(yàn)室已建立的多重PCR方法對(duì)病料進(jìn)行檢測(cè)，多重PCR中PCV2的鑒定性引物根據(jù)GenBank中發(fā)表的PCV2毒株(登錄號(hào)：KY806071)的ORF2基因設(shè)計(jì)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為353 bp。引物序列為：PCV2-F：5’-CGCTGGAGAAGGAAAAAT GG-3’；PCV2-R：5’-AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3’。7重PCR最佳反應(yīng)體系為50 μL：金牌MiX(Green)30 μL，上、下游引物濃度均為10 μmoL/L，引物量PRRSV、PCV2、PPV、SIV各0.5 μL，PRV、JEV、CSFV各1 μL，DNA/cDNA模板PRRSV、PCV2、PPV、SIV、JEV各1 μL，PRV、CSFV各1.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；54 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物6 μL于2% 1×TAE瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)(110 V，35 min)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.4 PCV2全基因的擴(kuò)增與克隆根據(jù)GenBank中發(fā)表的PCV2毒株全基因序列(登錄號(hào)：KT719404)設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增PCV2全基因的引物。引物序列為：PCV2q-F：5’-CGGGATTCCGACCAGCGCACTTCG GCATG-3’；PCV2q-R：5’-CCAAGCTTGGAATACT TACAGCGCACTTCT-3’。其中上、下游引物中的下劃線部分別是BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，加粗部分是添加的保護(hù)性堿基，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。采用引物PCV2q-F/R擴(kuò)增檢測(cè)出PCV2陽(yáng)性病料的病毒核酸，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 767 bp。PCR擴(kuò)增體系總體積25 μL：10×LA PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，LATaq酶0.25 μL，用dd H2O補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，59 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)(80 V，40 min)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。將目的片段回收后與pMD19-T載體4 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，取100 μL均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12～16 h，挑取單個(gè)白色菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定及BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5 PCV2全基因的序列分析應(yīng)用MegAlign、MEGA5.05軟件對(duì)貴州PCV2 分離株全基因組序列與GenBank上已收錄的國(guó)內(nèi)外毒株進(jìn)行比對(duì)分析，進(jìn)行核苷酸同源性分析及構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病料中PCV2的檢測(cè)結(jié)果利用多重PCR對(duì)貴州遵義、福泉、金沙、榕江、赫章等地區(qū)的20份病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在病料中擴(kuò)增出約353 bp的特異性條帶(見圖1)，與PCV2的目的片段相符。

圖1 檢測(cè)病料中PCV2擴(kuò)增結(jié)果M：DL 2 000 Marker； 1：多重PCR陽(yáng)性對(duì)照； 2～21：檢測(cè)病料； 22：陰性對(duì)照

2.2 PCV2全基因的擴(kuò)增與克隆以多重PCR檢測(cè)出的PCV2陽(yáng)性病料的核酸為模板，用PCV2全基因的引物PCV2q-F/PCV2q-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出約1 767 bp的目的條帶，與預(yù)期片段大小相符(見圖2)。將目的片段回收后與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，用氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定及BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定(見圖3)，獲得了陽(yáng)性重組質(zhì)粒，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

圖2 陽(yáng)性病料中PCV2全基因組的PCR擴(kuò)增結(jié)果 圖3 PCV2全基因的雙酶切鑒定結(jié)果 M：DL 2 000 Marker； 1：陰性對(duì)照； 2：遵義病料； 3～4：福泉病料； M：DL 5 000 Marker； 1：遵義病料； 2～3：福泉病料；5～6：金沙病料； 7～8：榕江病料； 9：赫章病料 4～5：金沙病料； 6～7：榕江病料； 8：赫章病料

2.3 PCV2全基因的序列分析將克隆測(cè)序成功的PCV2全基因序列與GenBank中其他已知毒株的序列進(jìn)行比較，8條貴州不同地區(qū)的PCV2全基因序列長(zhǎng)均為1 767 bp(見圖3)，分別命名為GZ-RJ1、GZ-RJ2、GZ-ZY1、GZ-ZY2、GZ-FQ1、GZ-FQ2、GZ-JS、GZ-HZ。8條序列間的核苷酸同源性為97.3%～99.9%，與GenBank中登錄的貴州2012—2013年分離的4株P(guān)CV2分離株核苷酸序列之間的同源性為75.8%～96.4%，與PCV2a型分離株的核苷酸序列同源性為77.2%～95%，與PCV2b型分離株的同源性為74.9%～96.1%，與PCV2e型分離株的同源性為91%～94.1%，與PCV2d型分離株的核苷酸序列同源性較高，達(dá)94.3%～99.9%(見圖4)。

為進(jìn)一步分析貴州PCV2分離株與其他毒株在遺傳進(jìn)化上的關(guān)系，利用MEGA6軟件建立了貴州PCV2分離株與其他國(guó)內(nèi)外毒株的遺傳進(jìn)化樹(見圖5)。不同基因型的毒株各處于1個(gè)分支，此次擴(kuò)增的8條貴州不同地區(qū)的PCV2全基因序列均與PCV2d型毒株處于同一個(gè)遺傳進(jìn)化分支，2012年分離的GZ-QZ1及GZ-RH1株也與 PCV2d型毒株處于同一遺傳進(jìn)化分支，而Kaiyang株與PCV2b型毒株處于同一遺傳進(jìn)化分支，GZ-CS1株與PCV2e型毒株處于同一遺傳進(jìn)化分支。

圖4 PCV2全基因組的核苷酸同源性分析

圖5 貴州PCV2分離株全基因序列與國(guó)內(nèi)外毒株的遺傳進(jìn)化樹分析

3 結(jié)論與討論

3.1豬圓環(huán)病毒病是近年來(lái)出現(xiàn)的影響世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，PCV2是引起該病的主要病原。PCV2的毒力雖然沒(méi)有豬瘟病毒、高致病性豬藍(lán)耳病病毒和偽狂犬病病毒強(qiáng)，但由于感染豬后使其免疫力降低，抗病能力下降，常出現(xiàn)混合感染和繼發(fā)感染，還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制。

3.2我國(guó)于2000年首次證實(shí)國(guó)內(nèi)豬群中存在PCV2感染，自此以后不斷有相關(guān)研究PCV2的報(bào)道。郭抗抗等[6]對(duì)NCBI中登錄的556個(gè)PCV2分離株全基因序列進(jìn)行分析顯示1999—2002年P(guān)CV2的優(yōu)勢(shì)流行毒株為PCV2a，從2003年開始PCV2b基因型逐漸成為優(yōu)勢(shì)流行毒株。PCV2c型毒株于1980、1987、1990年僅在丹麥有相關(guān)報(bào)道[7]，PCV2d型毒株則是我國(guó)新出現(xiàn)的基因型[8]。劉釗[9]對(duì)來(lái)源不同的6株貴州地區(qū)PCV2毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明：MJBM2015、ASXX2015 株為 PCV2b 基因型，CSGS2012 株、GYYY2015 株為 PCV2a 基因型，ZYMT2015、GYXW2014 株為 PCV2d 基因型。徐國(guó)[10]等對(duì)貴州省豬血清中檢測(cè)到的10株P(guān)CV-2進(jìn)行全基因組克隆與序列分析，結(jié)果表明：8株為PCV2b型，2株為PCV2a型。徐鍍涵[11]等為了解貴州省非免疫豬群PCV2感染情況，采用ELISA方法對(duì)貴州省7個(gè)市(州)714份血樣進(jìn)行檢測(cè)，采用PCR方法對(duì)20頭疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥病死豬進(jìn)行圓環(huán)病毒2型核酸檢測(cè)，結(jié)果：PCV2感染抗體陽(yáng)性率為45.94%；20頭病死豬樣本中檢出PCV2核酸陽(yáng)性18份，檢出率為90.00%。

3.3本研究通過(guò)用實(shí)驗(yàn)室所建立的多重PCR方法對(duì)2018年貴州不同地區(qū)的臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒等混合感染的情況較為多見。本次所克隆的8條貴州不同地區(qū)的PCV2全基因序列均屬于PCV2d基因型，近年來(lái)貴州地區(qū)豬群PCV2d基因型的感染病例增多，而2012年分離的GZ-QZ1、GZ-RH1株也與PCV2d型毒株處于同一遺傳進(jìn)化分支。李濤[12]等對(duì)3株P(guān)CV2貴州流行株全基因序列分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示：3株P(guān)CV2貴州流行株歸屬PCV2d分支，說(shuō)明PCV2d基因型已成為貴州地區(qū)的主導(dǎo)基因型。