趙康宏， 嚴(yán)思恩， 何英杰， 李大江， 劉東波，4， 謝紅旗，4?

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南省寶慶農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口有限公司，湖南 隆回422200；4.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙410128）

百合為百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium brownii F.E.Brown var.viridulum Baker.或細(xì)葉百合Lilium pumilum DC.的干燥肉質(zhì)鱗葉，多用于陰虛燥咳、勞嗽咳血、虛煩驚悸、失眠多夢(mèng)、精神恍惚等［1］，是1 種藥食同源兼具園藝觀賞性的藥材。

百合中［2-4］既含有酚類、皂苷、多糖、生物堿等活性成分，又含有蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素等營(yíng)養(yǎng)成分；其中植物多酚是1 種植物次生代謝產(chǎn)物，具有顯著的抗氧化活性［5］。由于體外抗氧化活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)具有易操作、低成本等優(yōu)點(diǎn)，目前常通過(guò)DPPH、ABTS、FRAP 等方式評(píng)價(jià)化合物體外抗氧化活性［6-7］，另外，由于HPLC 可以對(duì)化合物進(jìn)行分離與定量，酚類化合物與DPPH 和ABTS 反應(yīng)后的峰面積會(huì)出現(xiàn)顯著降低或是消失［8-10］，因此通過(guò)DPPH／ABTS+·-HPLC 聯(lián)用可快速判斷單個(gè)化合物是否具有抗氧化能力［11］。此外，隨著HPLC-MS 技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)化合物碎片離子提供的信息，為對(duì)其定性分析提供了1 種快速、準(zhǔn)確的方法。目前對(duì)百合中酚類化合物的體外抗氧化評(píng)價(jià)、HPLC-MS 分析的研究報(bào)道較多，但通過(guò)體外抗氧化評(píng)價(jià)及體外抗氧化與HPLC 聯(lián)用并結(jié)合HPLC-MS 定性分析的方式未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用3 種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方式及DPPH／ABTS+·-HPLC 聯(lián)用對(duì)百合中酚類化合物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)并基于HPLC-Q-TOF-MS 對(duì)其定性分析［12］，以期評(píng)價(jià)百合中酚類化合物抗氧化能力并對(duì)其進(jìn)行定性分析，為進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 材料 湖南省龍山縣龍山百合和隆回縣龍牙百合均購(gòu)自湖南省寶慶農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口有限公司，經(jīng)唐其副教授（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)） 鑒定為卷丹Lilium lancifolium Thunb.和百合Lilium brownii F.E.Brown var.viridulum Baker.。

1.1.2 試藥 甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；碳酸鈉、福林酚、沒(méi)食子酸、抗壞血酸、過(guò)硫酸鉀、冰醋酸、FeCl3、乙醇（均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司）；2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；蒸餾水。

1.1.3 儀器 UV-1800 （日本Shimadzu 公司）； HPLC（1260） -Q-TOF-MS（美國(guó)Angilent 公司）；KM5200DV 超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；XS205 分析天平（瑞士Mettler toledo 公司）。

1.2 供試品溶液制備 將2 種百合分別打粉后過(guò)60 目篩，將靳磊等［13］的方法稍加修改，提取條件為物液比=1 ∶20，提取時(shí)間30 min，提取溫度40 ℃，pH 7，提取溶劑80%乙醇，抽濾后再次提取，合并濾液，濃縮并將所得提取液用80%乙醇定容至100 mL 備用。

1.3 總多酚含有量測(cè)定 總多酚含有量測(cè)定采用福林酚法，將Jin L 等［7］的方法稍加調(diào)整，用蒸餾水配制質(zhì)量濃度0.1 mg／mL 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 量瓶，分別加入2.0 mL蒸餾水搖勻，再加入0.5 mL 福林酚試劑，搖勻靜置5 min后加入1.0 mL 15% Na2CO3溶液，搖勻并用蒸餾水定容，于765 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)（GA），樣品取1.0 mL 測(cè)定。

1.4 抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.4.1 抗壞血酸母液配制 將抗壞血酸用蒸餾水配置成10.0 mmol／L 母液備用。

1.4.2 DPPH 清除率測(cè)定 用甲醇配置40 μg／mL DPPH 溶液，將“1.4.1” 項(xiàng)下抗壞血酸母液稀釋200 倍后，依次移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于試管，用蒸餾水補(bǔ)足至5.0 mL，加入5.0 mL DPPH 溶液，搖勻，以5.0 mL 蒸餾水加5.0 mL DPPH 溶液作為對(duì)照組A（DC），以5.0 mL 蒸餾水加5.0 mL 甲醇做空白組A（DB）。室溫下避光反應(yīng)30 min后于517 nm 下測(cè)定吸光值A(chǔ)（VD），樣品取5.0 mL 測(cè)定。

1.4.3 ABTS+·抑制率測(cè)定 參照張華等［14］的方法配置ABTS+·溶液。將“1.4.1” 項(xiàng)下抗壞血酸母液稀釋100 倍，依次取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于試管，并補(bǔ)足至2.5 mL，然后分別加入5.0 mL ABTS+·溶液避光反應(yīng)10 min后于734 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)（VA）。以2.5 mL 蒸餾水加5.0 mL ABTS+·溶液做對(duì)照組A（AC），以蒸餾水做空白組A（AB），樣品稀釋5 倍后取1.0 mL 測(cè)定。

1.4.4 Fe3+還原能力測(cè)定 試劑配制方式參照Perumal Siddhuraju［15］等的方法。將“1.4.1” 項(xiàng)下抗壞血酸母液稀釋100 倍，依次取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于試管，并補(bǔ)足至2.0 mL，分別加入5.0 mL 反應(yīng)試劑，混勻后5 min 即可于λ=593 nm 下測(cè)定吸光值A(chǔ)（VF）。以2.0 mL蒸餾水加5.0 mL 反應(yīng)試劑做對(duì)照組A（FC），以蒸餾水做空白組A（FB），樣品取2.0 mL 測(cè)定。

1.5 DPPH／ABTS+·-HPLC 聯(lián)用抗氧化活性分析［16］

1.5.1 HPLC 條件優(yōu)化 經(jīng)色譜條件優(yōu)化，確定HPLC 條件為Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸水（A） -乙腈，梯度洗脫（0 ～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～19%B；10～20 min，19%～22%B；20 ～22 min，22%～25%B；22 ～30 min，25%～40%B；30～31 min，40%～10%B；31 ～40 min，10%B）；體積流量0.8 mL／min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)315 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.5.2 DPPH-HPLC 聯(lián)用分析 精密移取“1.2” 項(xiàng)下供試液1.0 mL 于10 mL 離心管，加入1.0 mL 40 μg／mL DPPH 溶液，搖勻避光反應(yīng)30 min 后引入HPLC 中，另各取1.0 mL 供試液加入1.0 mL 蒸餾水作對(duì)照組。

1.5.3 ABTS+·-HPLC 聯(lián)用分析 精密移取“1.2” 項(xiàng)下供試液1.0 mL 于10 mL 離心管，分別加入ABTS+·溶液1.0 mL，搖勻避光反應(yīng)10 min 后引入HPLC 中，另各取1.0 mL 供試液加入1.0 mL 蒸餾水作對(duì)照組。

1.6 HPLC-Q-TOF-MS 聯(lián)用 色譜條件采用“1.5.1” 項(xiàng)下條件。 質(zhì)譜條件采用負(fù)離子模式電噴霧電離離子源（ESI-）；TOF 質(zhì)量掃描范圍m／z 100 ～1 700；載氣溫度300 ℃；體積流量8 L／min；霧化壓力241.3 kPa；鞘氣溫度350 ℃；體積流量11 L／min；毛細(xì)管電壓3 500 V；碰撞誘導(dǎo)解離電壓175 V；設(shè)置碰撞能量梯度為10、20、30 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚含有量UV 測(cè)定 以沒(méi)食子酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（A），得回歸方程A=9.766 3X+0.060 1（R2=0.999 0）；總多酚含有量，隆回縣龍牙百合為（3.88±0.10） mg／g；龍山縣龍山百合為（7.79±0.07）mg／g。2 種百合總多酚含有量差異明顯。

2.2 體外抗氧化活性評(píng)價(jià) 2 種百合通過(guò)3 個(gè)體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，2 種百合中的酚類化合物都具有一定抗氧化能力。等量龍山百合（卷丹） 總多酚的抗壞血酸當(dāng)量DPPH 清除能力是龍牙百合 （百合） 的2.19 倍，ABTS+·清除能力是1.72 倍，F(xiàn)e3+螯合能力則是4.12 倍。三項(xiàng)測(cè)定結(jié)果存在差異，這可能與2 種百合中所含酚類化合物的種類不一致有關(guān)，并且這些酚類化合物與氧化劑的親和力存在差異，但都表明百合中的酚類化合物具有顯著的抗氧化活性。

表1 1.0 mg 總多酚的抗壞血酸當(dāng)量抗氧化能力

2.3 DPPH／ABTS+·-HPLC 聯(lián)用抗氧化分析 2種百合中的酚類化合物液相色譜圖及其與DPPH／ABTS+·反應(yīng)后引入HPLC 中的液相色譜圖見(jiàn)圖1，分別從龍山、龍牙百合中檢測(cè)出9 個(gè)、7 個(gè)酚類化合物，在與DPPH 和ABTS 反應(yīng)后，各個(gè)峰峰面積都出現(xiàn)了不同程度降低，但是龍牙百合中峰6 和7 在與DPPH 反應(yīng)時(shí)未表現(xiàn)出明顯活性，與ABTS反應(yīng)后下降顯著。龍山百合與DPPH／ABTS+·反應(yīng)前后HPLC 中各個(gè)峰面積變化柱狀圖見(jiàn)圖2，結(jié)果表明龍山百合中的9 個(gè)酚類化合物與2 種氧化劑都有親和力，都出現(xiàn)了明顯降低；龍牙百合與DPPH／ABTS 反應(yīng)前后HPLC 中各個(gè)峰面積變化柱狀圖見(jiàn)圖3，結(jié)果表明龍牙百合中的酚類化合物與ABTS 親和力強(qiáng)于與DPPH 的親和力。 “2.2” 項(xiàng)下結(jié)果表明，2 種百合中等量總多酚的抗壞血酸當(dāng)量抗氧化能力具有顯著差異，并且，該差異的倍數(shù)關(guān)系不固定，通過(guò)DPPH／ABTS-HPLC 柱前衍生進(jìn)一步表明，2 種百合中由于所含酚類化合物的種類不同，各個(gè)化合物與氧化劑親和力各異，導(dǎo)致等量總多酚抗氧化能力具有顯著差異。此外，龍牙百合中化合物7 與龍山百合中化合物9 保留時(shí)間一致，但前者在與DPPH 反應(yīng)時(shí)不表現(xiàn)出親和力，而后者則表現(xiàn)出較弱親和力，通過(guò)龍山百合中各個(gè)化合物與DPPH 反應(yīng)強(qiáng)度可以發(fā)現(xiàn)，化合物9 與DPPH 的親和力較差，2 種百合中同一化合物出現(xiàn)該差異，推測(cè)是由于其自身與DPPH 結(jié)合能力較差，在龍牙百合中含有量較低，在與其他化合物競(jìng)爭(zhēng)時(shí)未表現(xiàn)出明顯活性。

圖1 各樣品HPLC 色譜圖

圖2 龍山百合與DPPH／ABTS 反應(yīng)后峰面積變化情況柱狀圖

圖3 龍牙百合與DPPH／ABTS 反應(yīng)后峰面積變化情況柱狀圖

2.4 HPLC-Q-TOF-MS 聯(lián)用定性分析 實(shí)驗(yàn)采用負(fù)離子模式對(duì)2 種百合中的酚類化合物進(jìn)行掃描，圖4 是龍牙百合和龍山百合在負(fù)離子模式下的總離子流圖，總離子流圖中分別掃描出14 個(gè)和20 個(gè)化合物。分別對(duì)2 種百合中豐度較大的化合物做MS／MS 分析，相關(guān)離子信息見(jiàn)表2。

表2 中，化合物L(fēng)SND 和LYND 的準(zhǔn)分子離子峰m／z 都是232，MS／MS 裂解信息一致，但保留時(shí)間有一點(diǎn)差異，推測(cè)為同一化合物或是同分異構(gòu)體。以化合物L(fēng)SND 為例，［M-H］-=232.137 1； ［A-H2O］-=146.099 5 這可能是香豆素脫去一分子水形成，［A-H2O-CO2］-=102.070 1 也可能是其離子碎片，與文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道的1-O-p-香豆素甘油酯相似，推測(cè)該化合物分子式為C13H14O4，HPLC 中未檢測(cè)到，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5（1）。

圖4 各樣品HPLC 色譜圖和總離子流圖

表2 酚類化合物精確分子量及二級(jí)質(zhì)譜碎片信息

化合物L(fēng)S2、3、4 和LY2、3、5 的準(zhǔn)分子離子峰m／z都是399，保留時(shí)間相近，并且其MS／MS 碎片信息基本一致，這3 個(gè)化合物可能是同分異構(gòu)體。以化合物L(fēng)S2 為例，［M-H］-=399.156 0，［A1-H］-=163.057 8，香豆素精確分子質(zhì)量為164.16，在負(fù)離子模式下會(huì)丟失1 個(gè)H， ［A1-COOH·-H］-=117.047 6，［A2-H2O］-=145.041 8，這可能是香豆素發(fā)生脫羧和脫水后的離子碎片，與文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道的1-O-咖啡酸-3-O-p-香豆素甘油酯一致，分子式C21H20O8，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5（2）。

化合物L(fēng)S1 的準(zhǔn)分子離子峰為m／z 415.151 8，化合物L(fēng)Y1 與其相近，但龍牙百合的二級(jí)質(zhì)譜信息干擾較大，因此分析LS1 的碎片信息，化合物L(fēng)S1 有2 個(gè)豐度較大的離子碎片，［A1-H］-=179.056 3 和［A2-H］-=163.042 3；［A1-H］-為咖啡酸m／z 180.14 失去1 個(gè)H， ［A1-H-COOH·］-=134.014 4 是咖啡酸脫去1 個(gè)羧基形成， ［A2-H］-是香豆素m／z 164.16 失去1 個(gè)H， ［A2-H-COOH·］-=117.102 2 是香豆素發(fā)生了脫羧反應(yīng)，并且甘油基團(tuán)中C3 原子上的1 個(gè)H 可能被1 個(gè)-OH 取代，該化合物未見(jiàn)報(bào)道，推測(cè)分子式C21H20O9，命名為1-O-p-香豆素-3-O-咖啡酸-3-羥基甘油酯，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5（3）。

化合物L(fēng)S5 的準(zhǔn)分子離子峰為m／z 429.168 0，只在龍山百合中檢出，MS／MS 碎片信息為［A1-H］-=193.069 4，是阿魏酸m／z 194.19 丟失1 個(gè)H 形成， ［A2-H-COOH·］-=134.053 3 可能是咖啡酸的裂解碎片，但并未找到［A2-H］-=179.012 4 的相關(guān)信息，僅推測(cè)該化合物可能是文獻(xiàn)［17］報(bào)道過(guò)的1-O-咖啡酸-3-O-阿魏酸甘油酯，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5（4）。

化合物L(fēng)S7 的準(zhǔn)分子離子峰m／z 457.164 6，只在龍山百合中檢出，MS／MS 碎片信息為［M-H-C3H7O·］-=397.147 0，表明這個(gè)化合物依然有可能是對(duì)位取代的酚性甘油酯，并且甘油基團(tuán)中可能存在1 個(gè)雙鍵，［A1-H］-=179.053 1 可能是咖啡酸失去1 個(gè)H 形成，［A1-2H-COOH·］-=133.045 6 可能是咖啡酸失去2 個(gè)H 后發(fā)生脫羧形成的碎片離子； ［A2-H-2OCH3·］-=161.043 6 可能是芥子酸失去1 個(gè)H 再脫去2個(gè)-OCH3形成的碎片，該化合物未見(jiàn)報(bào)道，僅推測(cè)其可能是1-O-咖啡酸-3-O-芥子酸甘油酯，分子式C23H22O10，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5（5）。

化合物L(fēng)S8 的精確分子量m／z 163.055 2，只在龍山百合中檢出，與文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道的p-香豆素一致，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5（6）。

化合物L(fēng)S9 和LY7 的準(zhǔn)分子離子峰m／z 都是441，且保留時(shí)間比較接近，考慮為同一化合物或是同分異構(gòu)體，其MS／MS 碎片信息也基本一致，以化合物1 為例，［A-H］-=163.057 9， ［A-H-H2O］-=145.046 2， ［A-H-COOH·］-=117.049 5 符合香豆素質(zhì)譜裂解規(guī)律，［2 A-2H+C3H6O］-=381.149 2 表明是與一分子甘油對(duì)位取代， ［M-H］-=381.149 2，表明甘油基團(tuán)上可能有1 個(gè)H 被一分子-COOCH3取代，則分子式可能是C23H22O9，命名為1，3-Op-香豆素乙酸甘油酯，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5（7）。

綜上，龍山百合HPLC 中峰1-9（峰6 含有量過(guò)低，在做MS／MS 分析時(shí)雜離子干擾太大） 分別鑒定為1-O-咖啡酸-3-O-p-香豆素甘油酯（LS1）、1-O-p-香豆素-3-O-咖啡酸-3-羥基甘油酯（LS2、3、4 推測(cè)其是同分異構(gòu)體）、1-O-咖啡酸-3-O-阿魏酸甘油酯（LS5）、1-O-咖啡酸-3-O-芥子酸甘油酯（LS7）；p-香豆素（LS8）、1，3-O-p-香豆素乙酸甘油酯（LS9）；龍牙百合HPLC 中峰1-7（峰4、6 在MS 中未檢測(cè)到） 分別是1-O-咖啡酸-3-O-p-香豆素甘油酯（LY1）、1-O-p-香豆素-3-O-咖啡酸-3-羥基甘油酯（LY2、3、5 推測(cè)其為同分異構(gòu)體）、1，3-O-p-香豆素乙酸甘油酯（LY7）。另外，2 種百合中都含有1-O-p-香豆素甘油酯，但在HPLC中未檢測(cè)到。

圖5 MS／MS 推測(cè)各化合物結(jié)構(gòu)式

3 討論與結(jié)論

百合作為重要藥材與食材，分布范圍廣泛且品種繁多，對(duì)其化合物含有量及種類產(chǎn)生較大影響，湘產(chǎn)百合是中國(guó)百合的一個(gè)重要品種，本研究旨在對(duì)湖南省兩個(gè)具代表性產(chǎn)地的百合中具抗氧化能力的酚類化合物進(jìn)行分析，通過(guò)采用3 個(gè)體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方式，發(fā)現(xiàn)兩地所產(chǎn)百合都具有較強(qiáng)的抗氧化能力，這與之前相關(guān)研究［18-20］中對(duì)其他產(chǎn)地百合酚類化合物抗氧化活性評(píng)價(jià)相似，并且，兩種百合1.0 mg 總多酚抗壞血酸當(dāng)量抗氧化能力差異顯著，龍山縣產(chǎn)百合活性更強(qiáng)，表明兩種百合都具有作為抗氧化食品或藥品開(kāi)發(fā)的潛力；另外通過(guò)DPPH／ABTS+·-HPLC 柱前衍生在線抗氧化活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種百合中的酚類化合物種類不一樣，可能是導(dǎo)致其與氧化劑的結(jié)合能力有明顯差異的重要原因。

此外，由于質(zhì)譜可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)化合物定性分析，并且酚類化合物是天然產(chǎn)物表現(xiàn)活性的重要組分，關(guān)于酚類化合物的研究開(kāi)發(fā)是目前天然產(chǎn)物藥用價(jià)值及食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的重要方向，因此，百合中酚類化合物的質(zhì)譜研究已受到多方關(guān)注，這些研究不僅表明百合中含有多種酚類化合物，也表明這些酚類化合物種類及含有量與產(chǎn)地具有較大相關(guān)性，Wang 等［21］通過(guò)對(duì)6 種可食用分屬7 個(gè)產(chǎn)地的9個(gè)百合樣本定量分析結(jié)果表明，即使是同屬百合，當(dāng)處于不同產(chǎn)地種植時(shí)，總多酚含有量也具有一定差異，不同種百合的含有量差異也很明顯；并且，研究中通過(guò)HPLC-QTOF-MS 分析指出這些產(chǎn)地百合中含有11 種單體酚化合物，會(huì)隨著產(chǎn)地及品種的差異而產(chǎn)生差異。本研究通過(guò)MS／MS分析，表明百合中的酚類化合物是以多酚-甘油酯復(fù)合體的形式存在，從中一共鑒定出7 個(gè)化合物。

通過(guò)DPPH／ABTS-HPLC 聯(lián)用可以快速分析天然產(chǎn)物具有抗氧化能力的組分，并通過(guò)HPLC-Q-TOF-MS 可以快速對(duì)具抗氧化能力的組分進(jìn)行定性分析，但本實(shí)驗(yàn)中量效關(guān)系并不具體，希望在進(jìn)一步的研究中通過(guò)聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)其做精確定量分析，此外，對(duì)單個(gè)化合物的抗氧化評(píng)價(jià)也需要通過(guò)采用等質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品予以精確表征。