姚 彤， 吳春燕， 寧昶華， 杜帥帥， 王 榮， 曹永孝?

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，陜西 西安710061；2. 西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安710021）

頸椎病是在椎間盤退行性改變的基礎(chǔ)上受外力作用，使椎體及周圍組織發(fā)生病理改變，從而壓迫神經(jīng)、血管，并引起相應(yīng)的癥狀和體征［1-2］，以神經(jīng)根型發(fā)病率最高，其主要特點是椎間盤退行性改變致使脊神經(jīng)根受壓，表現(xiàn)為頸肩背疼痛、肢體麻木、活動受限甚至癱瘓等［3-4］。在頸椎病非手術(shù)治療方法中，西醫(yī)常用非甾體類藥物，但其不良反應(yīng)較多，尤以胃腸道反應(yīng)較為嚴(yán)重；在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，中藥療效理想，深受患者歡迎，以活血化瘀、通絡(luò)止痛、散風(fēng)除濕、益氣補腎類藥物為主［5-6］。其中，頸骨康膠囊是山西亞寶藥業(yè)集團股份有限公司研制的中藥復(fù)方制劑，由葛根、當(dāng)歸、杜仲、川芎、威靈仙、桂枝、獨活、熟地黃組成，具有活血化瘀、散風(fēng)止痛、舒經(jīng)活絡(luò)功效，主治因頸椎病所致的頸項強直、頭暈?zāi)垦！⒓绫程弁?，臨床治愈率78.5%，有效率97.1%［7］，但缺少系統(tǒng)藥效學(xué)資料，故本實驗研究頸骨康膠囊對神經(jīng)根型頸椎病大鼠的影響。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，體質(zhì)量200～250 g，雌雄兼用，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（陜）2012-003，顆粒飼料、常水喂養(yǎng)。

1.2 試藥 頸骨康膠囊（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號170201）；頸復(fù)康顆粒（承德頸復(fù)康藥業(yè)集團有限公司，批號710153）；布洛芬緩釋膠囊（中美天津史克制藥有限公司，批號17010347）；青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號F6092101）。

1.3 儀器 Aesthesio 機械痛閾測定套件 （意大利Ugo Basile 公司）；Scientz-48 高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；H1850R 臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（美國熱電公司）。

2 方法

2.1 模型建立［8］大鼠麻醉后消毒，鋪巾，由第2 胸椎沿棘突向上作一約3 cm 切口，眼科剪分離皮下組織和肌肉，鼻剝離器剝離第6 頸椎至第1 胸椎棘突兩側(cè)肌肉，充分暴露椎板，眼科鑷提起第2 胸椎棘突，同時用止血鉗夾開第1 胸椎椎板，暴露脊髓，鼻剝離器將脊髓輕撥至右側(cè)，顯微外科鑷將長約1.2 cm、直徑約0.8 mm 的尼龍漁線由第1胸椎沿脊髓縱向輕輕插入至第6 頸椎，放置在左側(cè)神經(jīng)根處，傷口處撒少量青霉素鈉粉末，逐層關(guān)閉傷口，縫合；假手術(shù)組大鼠除不放尼龍漁線外，其余操作同上。術(shù)后第5 天，按表1 標(biāo)準(zhǔn)進行步態(tài)評分［9-11］。

表1 大鼠步態(tài)評分標(biāo)準(zhǔn)

?

2.2 分組與給藥 將步態(tài)評分在2 ～3 分、未見脊髓壓迫癥狀的大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、頸復(fù)康顆粒組（2.0 g／kg）、布洛芬緩釋膠囊組（0.08 g／kg） 及頸骨康膠囊低、中、高劑量組（0.12、0.24、0.48 g／kg）。假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃蒸餾水，其余各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1 次，給藥量10 mL／kg，連續(xù)14 d（所有藥物溶于0.5%羧甲基纖維素鈉中）。實驗過程中，少數(shù)大鼠因感染、水合氯醛麻醉致腸梗阻死亡，導(dǎo)致缺失。

2.3 指標(biāo)檢測 于給藥前及給藥第7、14 天檢測。

2.3.1 自發(fā)痛［12］將大鼠置于透明鼠籠中，待其安靜后記錄5 min 內(nèi)左前肢離地累積時間，平行3 次，取平均值。

2.3.2 步態(tài)［9-11］觀察大鼠行走及休息時的姿勢，按表1對其因疼痛造成的步態(tài)障礙進行評分。

2.3.3 機械刺激痛閾 將大鼠固定，機械痛閾測定套件從小到大依次刺激其前足底中央，每個尼龍刺激針刺激2 次，間隔至少10 s，若在10 s 內(nèi)出現(xiàn)縮爪即為陽性反應(yīng)［13］；如果使用最大強度300 g 尼龍刺激針刺激后仍無陽性反應(yīng)，則本次閾值為300 g。記錄大鼠左右前足機械刺激痛閾，計算差值，平行3 次，取平均值。

2.3.4 游泳時間 將大鼠置于 （30±0.5）℃、水深約45 cm的水池中游泳，當(dāng)水面連續(xù)3 次沒過鼻尖、每次超過5 s 時將其撈出［14］，以大鼠入水至撈出的間隔為大鼠游泳時間。

2.3.5 組織病理學(xué)變化觀察 以上指標(biāo)評價完成后，CO2處死大鼠，取頸7～胸1 脊椎。固定于10%甲醛中24 h，清水沖洗后，20% EDTA 脫鈣10 d，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，橫斷面切片，HE 染色［15］，在光鏡下觀察。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理，計量資料以表示，方差分析有顯著性后，組間比較采用t檢驗；步態(tài)評分采用秩和檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 頸骨康膠囊對大鼠自發(fā)痛的影響 表2 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠左前肢離地時間顯著升高 （P ＜0.01）；與模型組比較，給藥第7、14 天頸骨康膠囊組大鼠該時間顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），也顯著低于給藥前（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 頸骨康膠囊對大鼠自發(fā)痛的影響

表2 頸骨康膠囊對大鼠自發(fā)痛的影響

注：與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與給藥前比較，#P＜0.05，##P＜0.01

假手術(shù)組組別 （g劑·—k量g -／1）離5地5±時28間??／給s藥前動物1數(shù)5／只 離4地4±時35間?給 ?／ 藥s第7動天物1數(shù)4 ／只 離4地4±時48間??／ s給藥第14動 天物1數(shù)2／只模型組 — 225±87△△ 15 224±87△△ 14 170±87△△ 14頸骨康膠囊組 0.12 204±98 15 118±61??## 14 104±75?## 13頸骨康膠囊組 0.24 215±73 14 109±74??## 12 76±93?## 11頸骨康膠囊組 0.48 197±79 14 131±74??# 13 79±67??## 13頸復(fù)康顆粒組 2.0 200±91 15 123±69??# 15 103±74?## 15布洛芬緩釋膠囊組 0.08 201±92 16 107±83??## 14 81±73?## 9

3.2 頸骨康膠囊對大鼠機械刺激痛閾的影響 表3 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠機械刺激痛閾差顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥第7、14 天頸骨康膠囊組大鼠該差值顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與給藥第7 天比較，給藥第14 天0.12、0.48／kg 組該差值顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 頸骨康膠囊對大鼠機械刺激痛閾的影響

表3 頸骨康膠囊對大鼠機械刺激痛閾的影響

注：與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與給藥第7 天比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）痛閾差／g給 藥前動物數(shù)／只 痛閾差給／g藥第7動天物數(shù)／只 痛閾差／g給藥第14動 天物數(shù)／只假手術(shù)組 — 20±39?? 15 33±28?? 14 31±42?? 12模型組 — 138±34△△ 15 128±24△△ 14 120±29△△ 14頸骨康膠囊組 0.12 132±40## 15 83±33?? 14 40±61??# 13頸骨康膠囊組 0.24 127±45# 14 77±57?? 12 37±43?? 11頸骨康膠囊組 0.48 139±64# 14 98±32? 13 34±30??## 13頸復(fù)康顆粒組 2.0 133±30## 15 60±37?? 15 15±65??# 15布洛芬緩釋膠囊組 0.08 135±48# 16 82±70? 14 16±61??# 9

3.3 頸骨康膠囊對大鼠步態(tài)的影響 表4 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠步態(tài)評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥第7、14 天頸骨康膠囊組該評分顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與給藥第7 天比較，給藥第14天頸骨康膠囊各劑量組該評分顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.4 頸骨康膠囊對大鼠游泳時間的影響 表5 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠游泳時間顯著縮短（P＜0.01）；與模型組比較，給藥第7、14 天頸骨康膠囊0.48 g／kg 組該時間顯著延長（P＜0.05）；與給藥前比較，給藥第7 天0.24 g／kg 組、給藥第14 天各劑量組該時間顯著延長（P＜0.05，P＜0.01）。

3.5 組織病理學(xué)變化 圖1 顯示，假手術(shù)組大鼠可見脊神經(jīng)節(jié)，大小不等、形態(tài)各異的節(jié)神經(jīng)細胞，較密集的有髓神經(jīng)橫斷和軸索，以及明顯的髓鞘，未見明顯的神經(jīng)元變性等病變；模型組大鼠可見脊神經(jīng)節(jié)、節(jié)細胞，以及個別散在的變性節(jié)細胞，正常的有髓神經(jīng)明顯減少（橫截面計數(shù)），也有增生的雪旺氏細胞；頸骨康膠囊0.48 g／kg 組大鼠脊神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)元病變不明顯，與模型組比較有髓神經(jīng)數(shù)量明顯增多，亦可見增生的雪旺氏細胞；頸骨康膠囊0.12、0.24 g／kg 組大鼠可見脊神經(jīng)節(jié)中節(jié)細胞和神經(jīng)纖維，較多的增生雪旺氏細胞，以及散在有髓神經(jīng)，與模型組比較差異不明顯；頸復(fù)康顆粒組與模型組比較，有髓神經(jīng)數(shù)量明顯增多。

表4 頸骨康膠囊對大鼠步態(tài)的影響

表4 頸骨康膠囊對大鼠步態(tài)的影響

注：與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與給藥第7 天比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）步態(tài)評分給藥前動物數(shù)／只 步態(tài)評分給 藥 第7動天物數(shù)／只 步態(tài)評分給藥第14動 天物數(shù)／只假手術(shù)組 — 1.0±0.0?? 15 1.0±0.0?? 14 1.0±0.0?? 12模型組 — 2.4±0.5△△ 15 2.4±0.5△△ 14 2.2±0.4△△ 14頸骨康膠囊組 0.12 2.7±0.5## 15 2.0±0.4? 14 1.5±0.5??## 13頸骨康膠囊組 0.24 2.6±0.5## 14 1.9±0.9? 12 1.5±0.5??# 11頸骨康膠囊組 0.48 2.4±0.5## 14 1.9±0.6? 13 1.5±0.8??# 13頸復(fù)康顆粒組 2.0 2.4±0.5## 15 1.9±0.6? 15 1.5±0.7??## 15布洛芬緩釋膠囊組 0.08 2.6±0.5## 16 2.1±0.6 14 1.3±0.7??## 9

表5 頸骨康膠囊對大鼠游泳時間的影響（x±s）

圖1 各組大鼠神經(jīng)病理切片（HE 染色）

4 討論

研究頸椎病時常用大鼠模型，具有費用低、周期短、取材方便等優(yōu)點；神經(jīng)根型頸椎病的造模方法主要有椎管插線法、單純機械性壓迫法、機械壓迫和化學(xué)刺激法、自身增生壓迫法等［16］，本實驗選擇椎管插線法。神經(jīng)根壓迫后血液循環(huán)會受影響，營養(yǎng)供應(yīng)發(fā)生障礙，毛細血管通透性增加，從而誘發(fā)水腫，并且可損害髓鞘，脫髓鞘處神經(jīng)纖維異常放電。研究表明，神經(jīng)根型頸椎病模型大鼠膠質(zhì)細胞激活時，可使IL-1β、IL-6 等炎癥細胞因子大量釋放［17-18］，導(dǎo)致自發(fā)疼痛、痛覺過敏、運動障礙，這些變化與頸椎病臨床表現(xiàn)相似。

本實驗通過檢測自發(fā)痛、機械刺激痛閾、步態(tài)、游泳時間4 個行為學(xué)指標(biāo)和觀察組織病理學(xué)變化，來評價頸骨康膠囊對神經(jīng)根型頸椎病大鼠的影響。結(jié)果顯示，大鼠神經(jīng)所支配肢體會產(chǎn)生明顯的自發(fā)疼痛和痛覺過敏；用機械痛閾測定套件測定大鼠左右前足的足跗痛閾值時，造模一側(cè)前足機械刺激痛閾減小，左右前足機械刺激痛閾差顯示模型神經(jīng)根損傷后的痛閾降低情況；頸骨康膠囊3 個劑量（0.12、0.24、0.48 g／kg） 均能明顯減輕大鼠自發(fā)痛，降低左右前足機械刺激痛閾差，表明它能緩解大鼠神經(jīng)壓迫和痛覺刺激癥狀。

神經(jīng)根型頸椎病大鼠神經(jīng)根受壓、炎癥刺激會影響運動神經(jīng)功能，表現(xiàn)為步態(tài)異常、游泳時間縮短。本實驗發(fā)現(xiàn)，頸骨康膠囊可明顯改善大鼠步態(tài)，延長游泳時間，可能是它改善大鼠神經(jīng)功能的結(jié)果。同時，病理結(jié)果顯示頸骨康膠囊對損傷的神經(jīng)也有恢復(fù)作用。

綜上所述，頸骨康膠囊對神經(jīng)根型大鼠頸椎病模型有明顯改善作用，可緩解自發(fā)疼痛，提高機械刺激痛閾，改善步態(tài)，延長游泳時間，恢復(fù)損傷神經(jīng)，即對該疾病有治療作用。