滕春曉， 金紅花，2?， 洪 蘭

（1.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉133000；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，吉林 延吉133000；3.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研部，吉林 延吉133000）

高血壓、心肌梗死、心肌炎等疾病均可導(dǎo)致心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡等病理生理改變，進(jìn)而發(fā)展為慢性心力衰竭，心肌纖維化是其病理基礎(chǔ)［1］，它是以心肌成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原蛋白生成增加、細(xì)胞外基質(zhì)過度失衡與沉積為主要表現(xiàn)的疾病［2］。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)在大多數(shù)心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)生活化，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ） 能促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖，膠原生成增多［3］，與心肌纖維化密切相關(guān)。五味子乙素是五味子主要藥用成分木脂素的成員之一［4］，對(duì)心臟有保護(hù)作用，但目前尚未明確其作用機(jī)制［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)考察五味子乙素對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌纖維化中AkT、mTOR、TGF-β1 表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 出生1～3 天的SD 大鼠乳鼠，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼 SCXK （吉）2017-0003。

1.2 試藥 五味子乙素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)P29J8F38066；AngⅡ購(gòu)自瑪雅試劑有限公司，批號(hào)MAYA-CR-7157；胎牛血清（FBS） 購(gòu)自美國(guó)Gemini 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS） 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMEM、雙抗（青霉素-鏈霉素溶液）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、蛋白激酶B（AkT）、雷帕霉素購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR、p-AKT 購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；β-actin 購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自長(zhǎng)春納川科技發(fā)展有限公司；牛血清白蛋白（BSA） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.3 儀器 371 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）公司；IX70-112 倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；EON 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek 公司；WE-180B 垂直電泳儀、VE-186 轉(zhuǎn)移電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司；Fluor chemuon 凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Protein Simple 公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞分離 14 只乳鼠浸入75%乙醇5 min 后取出，在超凈工作臺(tái)中將其胸部向上，小剪刀剪開乳鼠胸腔，充分露出心臟，放入37 ℃預(yù)熱的PBS 中，剔除大血管等組織，留取心尖部心室組織，PBS 洗滌1 次，剪碎（＜1 mm3）后移到50 mL 離心管中，棄去PBS，加入4 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶消化液，于37 ℃水浴消化10 min 后棄上清，剩余沉淀物用Ⅱ型膠原酶消化液搖動(dòng)消化4 次，每次10 min，收集上層細(xì)胞懸液，加入等量培養(yǎng)基終止反應(yīng)。將消化的細(xì)胞懸液收集到50 mL 離心管中，1 200 r／min 離心5 min，棄去上層液體，加入4 mL 培養(yǎng)基，移液管輕柔多次吹打，調(diào)整細(xì)胞密度，使細(xì)胞重新均勻懸浮后接種到培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min 進(jìn)行差速貼壁，吸出培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次去除血污，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

2.2 分組 將心肌成纖維細(xì)胞用含0.1% FBS、3%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h 進(jìn)行同化實(shí)驗(yàn)。①對(duì)照組，不作任何處理；②AngⅡ組，1×10-7mol／L AngⅡ處理細(xì)胞1、24 h；③AngⅡ+五味子乙素低劑量組，1×10-7mol／LAngⅡ和2.5×10-5mol／L 五味子乙素處理細(xì)胞1、24 h；④AngⅡ+五味子乙素高劑量組，1×10-7mol／L AngⅡ和7.5×10-5mol／L 五味子乙素處理細(xì)胞1、24 h；⑤AngⅡ+雷帕霉素組，1×10-7mol／L AngⅡ和1×10-8mol／L 雷帕霉素處理細(xì)胞1、24 h。

2.3 Western blot 檢測(cè) BCA 蛋白濃度法測(cè)定心肌成纖維細(xì)胞總蛋白量。每個(gè)孔中加入50 μg 蛋白質(zhì)，用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，1%BSA 磷酸鹽緩沖液（PBST） 中室溫封閉2 h，分別加入1 ∶1 000 兔抗mTOR、p-mTOR、AkT、TGFβ1、Collagen Ⅰ；1 ∶2 500 兔抗β-actin；1 ∶5 000 兔抗p-AkT，4 ℃冰箱中搖動(dòng)孵育過夜，PBST 中洗膜10 min（3次），加入二抗（1 ∶3 500），室溫下振搖2 h，PBST 洗膜10 min （3 次）。 然 后， 加 入 ECL 試 劑 發(fā) 光， 通 過FluorChem FC3 軟件進(jìn)行灰度值掃描，并分別與β-actin 灰度值比較。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS17.0 軟件處理，計(jì)量資料以表示，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 圖1 顯示，培養(yǎng)60 min 后大多數(shù)心肌成纖維細(xì)胞基本完成貼壁，生長(zhǎng)出偽足且伸展為梭形，零星分散生長(zhǎng)。心肌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，可在2 ～3 d 內(nèi)基本達(dá)到培養(yǎng)皿的80%～90%，細(xì)胞排列均勻緊密，沒有自發(fā)性搏動(dòng)，呈長(zhǎng)梭形或者多邊形，細(xì)胞體比較大且胞質(zhì)澄明，細(xì)胞核清晰碩大。

圖1 第2 代心肌成纖維細(xì)胞（×100）

3.2 五味子乙素對(duì)p-AkT 蛋白表達(dá)的影響 圖2 顯示，與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ組p-AkT 蛋白表達(dá)顯著下調(diào) （P ＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+五味子乙素組其蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。

圖2 五味子乙素對(duì)p-AkT 蛋白表達(dá)的影響

3.3 五味子乙素對(duì)p-mTOR 蛋白表達(dá)的影響 圖3 顯示，與對(duì)照組比較，AngⅡ組p-mTOR 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+五味子乙素組其蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。

圖3 五味子乙素對(duì)p-mTOR 蛋白表達(dá)的影響

3.4 五味子乙素對(duì)TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表達(dá)的影響圖4 顯示，與對(duì)照組比較，AngⅡ組TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+五味子乙素組兩者蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以AngⅡ?yàn)榇碳ひ蜃咏⑿募±w維化模型，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較處理后心肌成纖維細(xì)胞可使p-mTOR、TGF-β1 和CollagenⅠ表達(dá)明顯升高，p-AkT 表達(dá)明顯降低；與Ang Ⅱ組 比 較， 五 味 子 乙 素 組 （2.5×10-5、 7.5×10-5mol／L） 組發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn)。由此證實(shí)，五味子乙素可呈劑量依賴性地下調(diào)p-mTOR、TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表達(dá)，上調(diào)p-AKT 蛋白表達(dá)來改善AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化。

五味子性味酸、甘，溫，歸肺、心、腎經(jīng)，功效收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心［6］，具有安定心神的功效，適用于心神不安之失眠多夢(mèng)、心悸等，對(duì)心氣不足者，可補(bǔ)益心氣［7］；對(duì)心腎陰虛者，又能滋養(yǎng)心腎，常與滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)心安神之品配伍［8］。五味子乙素為五味子主要活性成分之一，對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用，可減輕氧自由基的侵害，抑制心肌細(xì)胞凋亡，維持心血管舒張功能，對(duì)DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性具有保護(hù)作用［9］，還可通過降低TGF-β1 蛋白表達(dá)來起到抗腎纖維化的作用［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該成分可改善心肌纖維化。

當(dāng)心肌損傷時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞異常增殖，并分泌大量膠原蛋白，病理性細(xì)胞外基質(zhì)積聚，引起心肌膠原過量聚集且膠原比列失調(diào)，最終導(dǎo)致心肌纖維化［11-12］；AngⅡ可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖、分化、合成，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，通過與其受體結(jié)合后能活化細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路，在心肌纖維化中具有重要作用［3］。 活化的mTOR 信號(hào)通路參與纖維化病變，抑制該信號(hào)通路時(shí)可通過減少細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)來抑制纖維化形成［13］，它作為該信號(hào)通路中最主要的信號(hào)分子，參與了多種生理、病理過程，不僅具有蛋白激酶功能，而且在反映生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)狀況的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著重要調(diào)控作用［14］，而且體外TGF-β1 誘導(dǎo)的原代人肺成纖維細(xì)胞纖維化模型與mTORC1活性升高，膠原、纖維黏連蛋白分泌增多有關(guān)［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，五味子乙素可使mTOR 磷酸化水平降低，從而起到改善心肌纖維化的作用。

圖4 五味子乙素對(duì)TGF-β1（A）、CollagenⅠ（B） 蛋白表達(dá)的影響

AkT 作為mTOR 信號(hào)通路的上游效應(yīng)因子之一，參與心臟中多種細(xì)胞凋亡、代謝和心力衰竭發(fā)生發(fā)展［16］，有研究表明［17］，通過調(diào)控心肌細(xì)胞PI3K／AkT 信號(hào)通路可對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大起保護(hù)作用；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AkT 參與心肌成纖維細(xì)胞中AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化。TGF-β 在細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、炎癥、纖維化、腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中與心肌纖維化密切相關(guān)的因子是TGF-β1，它可通過TGF-β／Smads 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)心肌成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)合成與沉積，是促心肌纖維化的最主要因素之一［18-19］；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，五味子乙素在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化中可通過下調(diào)TGF-β1 表達(dá)來發(fā)揮作用，而且TGF-β 與AngⅡ組成的工作網(wǎng)在纖維化形成中有著至關(guān)重要的作用，同時(shí)與其他信號(hào)通路相互影響［1］。雷帕霉素可抑制TGF-β 信號(hào)通路，并減少Collagen Ⅰ分泌［20］；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該藥物可使TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表達(dá)降低，從而改善心肌纖維化。

綜上所述，五味子乙素可通過促進(jìn)AkT 磷酸化，抑制p-mTOR、TGF-β1 蛋白表達(dá)，減少CollagenⅠ合成，從而呈劑量依賴性的抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化，可為該成分在心臟保護(hù)方面的研究提供參考，也為未來相關(guān)臨床治療拓展新思路。