王一蓉， 周志宏， 湯長發(fā)， 魏 霞， 葉志文

（1.湖南體育職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙410019；2.湖南師范大學(xué)體育學(xué)院，湖南 長沙410081）

運動性低血睪酮一直是競技體育界最關(guān)心的問題，長時間高負荷運動訓(xùn)練能引起血睪酮水平下降，進而導(dǎo)致體能、運動能力降低或產(chǎn)生疲勞［1］，其主要原因是HPG 軸功能的多個環(huán)節(jié)被抑制［2］。目前，在睪丸Leydig 細胞水平層面，因LH／CG 受體、P450SCC、β2-腎上腺素受體等環(huán)節(jié)改變引起睪酮降低均有報道，但鮮有關(guān)注運動訓(xùn)練、營養(yǎng)干預(yù)對睪酮生物合成途徑相關(guān)酶的影響。

睪丸Leydig 細胞含有較多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，是合成和分泌睪酮的場所。下丘腦-垂體對睪丸分泌睪酮的調(diào)節(jié)變化最終要通過細胞內(nèi)睪酮合成時反應(yīng)底物轉(zhuǎn)運、酶促反應(yīng)等幾個關(guān)鍵步驟實現(xiàn)。膽固醇作為睪酮生物合成的起始物質(zhì)，其來源的主要途徑為膽固醇內(nèi)源性合成、外源性膽固醇攝取和逆轉(zhuǎn)運， 而甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMG-CoA）、低密度脂蛋白受體（LDL-R）、高密度脂蛋白受體（SR-BI） 分別是這2 條途徑的關(guān)鍵因素。然后，由類固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR） 介導(dǎo)甾體合成，從線粒體膜外向膜內(nèi)轉(zhuǎn)運， 通過 P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc，由CYP11A1 基因表達） 催化，并合成睪酮［3］。

本實驗探索補腎益元方對運動性低血睪酮大鼠睪丸Leydig 細胞睪酮合成酶的影響，以方中臣藥淫羊藿提取物為陽性對照，觀察細胞超微結(jié)構(gòu)及睪酮合成相關(guān)酶變化，探討該方對防治大鼠運動性低血睪酮的有效性和分子機制。

1 材料

SPF 級雄性SD 大鼠40 只（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），體質(zhì)量（300±10） g，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2013-0004，溫度23 ～25 ℃，相對濕度40%～60%，每天光照時間5 h。H7700 透射電鏡（日本日立公司）；164-5050 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；DYCZ-40 A轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）。Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20 等購自美國Sigma 公司。

淫羊藿提取物制備方法為取適量藥材粉末，用44%乙醇按液料比25 ∶1，在80 ℃水浴中浸提56 min，每5 min搖勻1 次，進行第1 次提取；第2 次提取時用44%乙醇按液料比20 ∶1，在80 ℃水浴中浸提40 min，合并2 次浸提液，回收乙醇，得到總黃酮質(zhì)量濃度為3.5 mg／mL 的濃縮液，加蒸餾水稀釋成2.5 mg／mL，以1 mL／min 體積流量上樣。充分吸附后，先以2.5 BV10%乙醇洗脫除去極性大的雜質(zhì)， 再以4 BV70%乙醇洗脫得總黃酮， 體積流量1.5 mL／min?？傸S酮洗脫液回收乙醇后稀釋，以水-乙酸乙酯1 ∶2 的比例萃取5 次，每次10 min，合并乙酸乙酯相，即得。

補腎益元方由人參皂苷、淫羊藿苷、枸杞多糖，以及其他提取物（女貞子、黃芪、仙鶴草、大伸筋草、卷柏等） 組成，為褐色粉末，由該復(fù)方所制得膠囊的平均粒重為0.543 1 g，由西安天一生物技術(shù)股份有限公司制作并提供（批號201500139），具有補肝腎、強筋骨、補氣活血、祛風(fēng)通絡(luò)功效。課題組前期通過HPLC 法，測得每粒膠囊中分別含人參總皂苷、淫羊藿苷43.57、5.03 mg。

2 方法

2.1 分組與給藥 40 只大鼠隨機分為空白組、模型組、淫羊藿提取物組及補腎益元方低、高劑量組，其中淫羊藿提取物組劑量為0.70 g／kg；補腎益元方低、高劑量組劑量分別為0.35、0.70 g／kg，復(fù)方用生理鹽水溶解后配成4 mL溶液，高劑量用量與成人持平［4］。給藥組大鼠運動前1 h灌胃給藥；空白組、模型組大鼠正常飲食，每天灌胃4 mL生理鹽水，連續(xù)6 周。

2.2 模型建立 采用逐級遞增負荷跑臺的方案建立大鼠運動性低血睪酮動物模型，以血睪酮較訓(xùn)練前下降15%為判斷依據(jù)［5］。該方案是參照Bedford 在1979 年根據(jù)大鼠體質(zhì)量／攝氧量回歸方程所建立的逐漸遞增速度和時間的運動訓(xùn)練方式，周期6 周，每周訓(xùn)練6 d，坡度保持在0°，最后1 d進行力竭運動。

2.3 取樣與指標(biāo)檢測 大鼠6 周訓(xùn)練結(jié)束后次日，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉，腹主動脈血制備血清，置于-20 ℃冰箱中保存，用于測定血清皮質(zhì)醇、睪酮水平；取大鼠外周血，半自動生化分析儀檢測血清總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-CE）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-CE） 水平；無菌環(huán)境下取大鼠雙側(cè)睪丸（盡量是同側(cè)同一部位）進行電鏡觀察，放入電鏡保存液；Percoll 梯度離心法分離制備睪丸Leydig 細胞，-80 ℃下冷凍保存，Western blot 法檢 測HMG-COA、 LDL-R、 SR-BI、 StAR、 CYP11A1 蛋 白表達。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補腎益元方對睪酮、皮質(zhì)醇、總膽固醇、HDL-CE、LDL-CE 水平的影響 表1 顯示，與空白組比較，模型組睪酮水平、睪酮／皮質(zhì)醇顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，補腎益元方組兩者顯著升高（P＜0.01）。

表1 補腎益元方對睪酮、皮質(zhì)醇、總膽固醇、HDL-CE、LDL-CE 水平的影響

表1 補腎益元方對睪酮、皮質(zhì)醇、總膽固醇、HDL-CE、LDL-CE 水平的影響

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

組別 （μ睪g·酮dL／-1） （皮μg·質(zhì)d醇L-1／） 睪酮／皮質(zhì)醇 （總mm膽o固l·L醇-1／） （m HmD L ol·-C L E-1／） （m LD m L ol-·CLE-／1）空模淫補補白型羊腎腎組組藿益益 提元元 取方方物低高組劑劑 量量 組組 11222 81012 75600.....05865 51306 08307±±±±±41551 83..4..50.30387 15741 034???? ###? ? 11111.....77777 54888 85726±±±±±00000.....32321 48216 34817 1111 06112 87994.....98532 23385 90207±±±±±31211 64534.....02007 08318 08799 #??##??? ? 10001.....09990 38988 70514±±±±±00000.....11011 04602 11870 22222.....22222 13210 83655±±±±±00000.....10011 68916 45818 00000.....55555 13223 31701±±±±±00000.....01100 93096 62523

3.2 補腎益元方對大鼠睪丸Leydig 細胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響 圖1 顯示，空白組大鼠睪丸細胞結(jié)構(gòu)正常，少部分細胞輕微水腫，但細胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰；模型組大鼠間質(zhì)水腫嚴重，部分細胞水腫、壞死、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，細胞膜破裂，少部分線粒體空泡變，染色質(zhì)邊集、裸核；淫羊藿提取物組大鼠間質(zhì)、部分細胞輕微水腫，細胞膜破裂；補腎益元方低劑量組大鼠部分細胞輕微水腫，少量線粒體體空泡變，溶酶體增多；補腎益元方高劑量組大鼠間質(zhì)輕微水腫，部分間質(zhì)細胞少量線粒體空泡，溶酶體增多，部分細胞染色質(zhì)邊集，細胞結(jié)構(gòu)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見。

圖1 各組大鼠睪丸間質(zhì)細胞超細微結(jié)構(gòu)

3.3 補 腎 益 元 方 對HMG-COA、 LDL-R、 SR-BI、 StAR、CYP11A1 蛋白表達的影響 表2、圖2 顯示，與空白組比較，模型組HMG-COA、StAR、CYP11A1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）：與模型組比較，補腎益元方組三者蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。

4 討論

4.1 大鼠睪丸Leydig 細胞超微結(jié)構(gòu)改變 在大鼠睪丸Leydig 細胞的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，含有合成睪酮的一系列關(guān)鍵酶，如催化膽固醇合成睪酮2 個最重要的限速酶P450scc、StAR，故兩者在細胞合成和分泌睪酮中起到重要

表2 補腎益元方對HMG-CoA、LDL-R、SR-BI、StAR、CYP11A1 蛋白表達的影響

表2 補腎益元方對HMG-CoA、LDL-R、SR-BI、StAR、CYP11A1 蛋白表達的影響

組別 HMG-CoA LDL-R SR-BI STAR CYP11A1空模淫補補白型羊腎腎組組藿益益 提元元 取方方物低高組劑劑 量量 組組 00000.....43444 12579±±±±±00000.....00000 13111 39929 #?###??? ?? 00000.....44434 58291±±±±±00000.....00000 36332 57185 00000.....33333 73223±±±±±00000.....00000 34223 52892 00000.....33444 83262±±±±±00000.....00000 21123 17892 #?#? ???? 00000.....43445 58161±±±±±00000.....00000 21221 24125#△??#? ?△

圖2 各 組 HMG-COA、 LDL-R、 SR-BI、 STAR、CYP11A1 蛋白表達灰度

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01；與補腎益元方高劑量組比較，△△P＜0.01作用［6-7］。李維仁等［8］通過電鏡觀察老年人睪丸Leydig 細胞，發(fā)現(xiàn)部分線粒體水腫，脂滴含有量降低，可能與睪酮降低緊密相關(guān)；也有人認為，睪酮水平下降是由于睪丸Leydig 細胞數(shù)量的減少［9］；朱寶安、Luo 等［10-11］報道，睪丸Leydig 細胞過度凋亡造成睪酮分泌明顯下降。

本實驗發(fā)現(xiàn)，大強度運動對大鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)造成明顯破壞，尤其是模型組出現(xiàn)間質(zhì)細胞水腫、壞死，部分細胞膜破裂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，染色質(zhì)出現(xiàn)邊集、裸核、細胞核固縮等現(xiàn)象，表明細胞損傷必然會影響睪酮合成及分泌，與鄭菁等［12］報道基本一致；補腎益元方干預(yù)后，睪丸Leydig 細胞的水腫狀況得到改善，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體結(jié)構(gòu)大致清晰可見，表明該方通過保護和修復(fù)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體結(jié)構(gòu)來維持其正常功能，從而促進睪酮的分泌，與石幼琪等［13］研究結(jié)果十分接近。

4.2 大鼠睪丸Leydig 細胞膽固醇合成限速酶HMG-CoA、LDL-R、SR-BI 蛋白表達 HMG-CoA 還原酶催化HMG-CoA轉(zhuǎn)變成甲基二羥基戊酸，是膽固醇內(nèi)源性合成過程限速酶，其活性高低直接決定血漿膽固醇的水平［14］。嚴翊等［15］比較5 周間歇性負重游泳訓(xùn)練和多增加1 周訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)兩者血睪酮明顯降低，但5 周未出現(xiàn)睪丸Leydig 細胞HMG-CoA還原酶基因表達變化，而增加1 周后其表達顯著降低，這與本實驗結(jié)果基本一致，可能是運動造成血睪酮降低，從而抑制細胞HMG-CoA 還原酶基因表達。本實驗發(fā)現(xiàn)，給藥組HMG-CoA 還原酶蛋白表達明顯高于空白組、模型組，但不同劑量之間無明顯差異，表明淫羊藿提取物、補腎益元方有助于睪丸Leydig 細胞內(nèi)膽固醇生物合成，從而提高大鼠睪酮分泌，但這與紀綱［16］研究結(jié)果恰好相反。

睪丸Leydig 細胞可分別通過LDL-R 介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和／或SR-BI 介導(dǎo)的膽固醇選擇性吸收途徑來攝取血液中膽固醇，其主要功能是通過攝取LDL-CE 進入細胞內(nèi)，產(chǎn)生游離膽固醇，并且LDL-R 合成速度及活性與細胞內(nèi)膽固醇含有量呈反比［17］，研究表明，有氧運動可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)大鼠肝臟LDL-R 基因表達，通過增加細胞內(nèi)膽固醇的利用或降解影響LDL-R 合成，增加肝臟攝取，從而改善血脂水平，預(yù)防高脂飲食引起的LDL 代謝異常［18］； SR-BI 是HDL-CE 的高親和力受體，也是膽固醇流出與流入的重要載體，主要介導(dǎo)血漿膽固醇逆向轉(zhuǎn)運回肝臟和類固醇激素生成組織進行代謝的過程［19］。本實驗發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組血清睪酮明顯降低時大鼠睪丸Leydig 細胞LDLR 蛋白表達略微增加，但不明顯，與張勇等［20］報道一致；給藥組血清睪酮明顯升高時，該蛋白表達略微降低，但不明顯，表明給藥后可能HMG-CoA 還原酶主導(dǎo)的細胞內(nèi)膽固醇生物合成增加，從而使LDL-R 轉(zhuǎn)錄攝取外源性膽固醇的通路受到抑制；與空白組比較，給藥組SR-BI 蛋白表達均有所下降，但不明顯，血清總膽固醇、LDL-CE、HDLCE 水平亦然，與田振軍［21］、嚴翊［15］報道一致，提示由SR-BI 介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)運攝取外源性膽固醇通路發(fā)生了障礙，而且血清膽固醇變化可能與運動訓(xùn)練的時間、強度、方式有關(guān)。

當(dāng)睪丸Leydig 細胞內(nèi)睪酮水平降低時，可能首先通過HMG-CoA 還原酶主導(dǎo)膽固醇生物合成，其次是刺激LDL-R的轉(zhuǎn)錄，然后是SR-BI 介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)運攝入外源性膽固醇，但三者之間膽固醇生成順序還有待進一步研究。見圖3。

圖3 睪丸Leydig 細胞內(nèi)膽固醇來源

4.3 大鼠睪丸Leydig 細胞睪酮合成限速酶CYP11A1、StAR 蛋白表達 正常生理條件下，間質(zhì)細胞內(nèi)睪酮合成的第一步是由StAR 介導(dǎo)甾體合成的限速步驟——將膽固醇從線粒體膜外向膜內(nèi)轉(zhuǎn)運，然后P450scc（由CYP11A1 基因表達） 對線粒體內(nèi)基質(zhì)膜內(nèi)表面上的膽固醇催化生成孕烯醇酮，最終合成睪酮［22］。CYP11A1、StAR 蛋白表達高低及活性與睪酮生成顯著相關(guān)［23］， Wang 等［24］發(fā)現(xiàn)兩者mRNA 表達在45 d 達到最大值，此階段可能是睪酮合成的快速時期；管永波等［25］用氟化鈉抑制兩者mRNA 表達，首先影響孕酮合成，從而影響睪酮合成，致使雄性心生殖系統(tǒng)出現(xiàn)損傷；景曉平等［26］報道，雷公藤多苷可使幼年大鼠睪酮水平明顯降低，睪丸組織CYP11A1 蛋白表達下降，而補腎類中藥可提高雄鼠睪酮水平，從而保護生殖損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組CYP11A1、StAR 蛋白表達較空白組明顯降低，表明它們與睪酮生成高低呈顯著正相關(guān)，與Zhao等［27］實驗結(jié)果一致；補腎益元方組睪丸Leydig 細胞兩者蛋白表達明顯增加，并高于淫羊藿提取物組，表明該方能提高兩者活性，從而促進膽固醇合成睪酮，與王建明等［28］報道一致。

補腎益元方可能通過睪丸Leydig 細胞內(nèi)膽固醇內(nèi)源性合成以及合成睪酮來影響血睪酮濃度，但對由LDL-R 轉(zhuǎn)錄和／或SR-BI 介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)運影響膽固醇合成的分子機制尚不明確，還需要進一步探討。