林大專， 張義英， 王俊儒

（1.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春130031；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西 楊凌712100）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，主要有效成分為水溶性的酚酸類和脂溶性的丹參酮類，藥理活性廣泛，在治療心血管疾病、肝硬化、潰瘍、腫廇、新生兒缺氧性腦病等具有顯著療效［1］。上述2種成分在同一工藝中不易兼得，但多種新技術(shù)聯(lián)合、多種成分標(biāo)準(zhǔn)控制的生產(chǎn)工藝是近幾年發(fā)展趨勢，后者一般采取傳統(tǒng)的回流提取，適合工業(yè)化生產(chǎn)［2］；也有用超聲提取的，提取率較高［3］，一般作為輔助技術(shù)；還有超臨界萃取法，但成本較高［4］，而前者常采用水煮醇沉法。目前，尚無對(duì)丹參中脂溶性、水溶性成分同時(shí)提取的報(bào)道，故建立聯(lián)合提取工藝很有必要，這樣既可降低成本，又能提高有效成分利用率，故本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化丹參中有效成分（酚酸類和丹參醌類） 聯(lián)合提取（回流提取為主，超聲提取為輔） 工藝，以期為這些成分開發(fā)利用提供參考。

1 材料

丹參購于安國市昌達(dá)中藥材飲片有限公司，經(jīng)長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生藥教研室王月珍老師鑒定為正品，符合2015 年版《中國藥典》 一部規(guī)定。丹參酮ⅡA對(duì)照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)Q0070291，50 mg，含有量≥99%）；丹酚酸B 對(duì)照品（北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司，批號(hào)151219，20 mg／支，含有量≥98%）；

Agilent 1200 高效液相色譜儀，配置Agilent 1200 可變波長檢測器（VWD）、Agilent 1200 數(shù)據(jù)站、P／N-7725i 手動(dòng)進(jìn)樣器、G1354A 四元梯度泵、G1316A 柱溫箱 （美國Agilent 公司）；BS224S 電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；KQ-2200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-2 恒溫水浴鍋（金壇市新航儀器廠）。

甲醇為色譜純（上海興科高淳溶劑有限公司，批號(hào)021260703）；乙腈為色譜純（美國Honeywell 公司，批號(hào)10071743）； 無 水 乙 醇 （批 號(hào)2015130）、 甲 酸 （批 號(hào)20040315） 為分析純（北京化工廠）。

2 方法

2.1 聯(lián)合提取 參考文獻(xiàn)［5］ 發(fā)現(xiàn)，70%乙醇提取效果最好，同時(shí)結(jié)合脂溶性或水溶性單一成分采用超聲提取。取丹參約2.0 g，先用6 倍量70%乙醇超聲提取2 次，每次30 min，溫度50 ℃，合并提取液，然后藥渣進(jìn)行回流提取，最后將超聲、回流提取液合并，定容于100 mL 量瓶中。以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為影響因素，正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，因素水平見表1，結(jié)果見圖1～2。

表1 因素水平

圖1 提取次數(shù)對(duì)丹參酮ⅡA 提取率的影響

2.2 丹參酮ⅡA含有量測定

圖2 提取次數(shù)對(duì)丹酚酸B 提取率的影響

2.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-水（80 ∶20）；檢測波長270 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品0.005 2 g，甲醇溶解定容至50 mL，即得（104 μg／mL）。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，精密量取20 μL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積（Y） 對(duì)溶液質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y=164.4X+33.76（r=0.999 3），在5.2～31.2 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液1.5 mL 于10 mL量瓶中，甲醇定容至10 mL，平行6 份，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得丹參酮ⅡA峰面積RSD 為1.261%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取丹參10 g 于250 mL 錐形瓶中，6倍量70%乙醇提取2 次，提取液濃縮至50 mL，精密量取15 mL 于25 mL 量瓶中，70%乙醇定容，搖勻，取6 份，每隔40 min 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定至4 h，測得丹參酮ⅡA峰面積RSD 為0.858%，表明溶液在4 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.5” 項(xiàng)下方法制備提取液，平行6 次，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得丹參酮ⅡA含有量RSD 為1.694%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取提取液4.0 mL 于10 mL量瓶中，共9 份，加入丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5 mL，分別配制成高、中、低質(zhì)量濃度，各3 份，70%乙醇定容，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，丹參酮ⅡA平均加樣回收率為100.75%，RSD為1.07%。

2.3 丹酚酸B 含有量測定

2.3.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-乙腈-甲酸-水（25 ∶15 ∶1 ∶59）；檢測波長286 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫20 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B 對(duì)照品0.025 0 g，80%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，即得（1 mg／mL）。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 至5 mL 量瓶中，80%甲醇定容至5 mL，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積（Y） 對(duì)溶液質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y=16 780X-669.89（r=0.999 4），在0.1～0.7 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液1.0 mL 至5 mL量瓶中，80%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取6 份，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得丹酚酸B 峰面積RSD 為0.473%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取藥材約2 g 于100 mL 具塞錐形瓶中，加入10 倍量50%乙醇，40 ℃下超聲提取3 次，每次30 min，提取液過濾合并，定容至100 mL 量瓶中，取6 份，每隔40 min 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定至4 h，測得丹酚酸B 峰面積RSD 為0.617%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.5” 項(xiàng)下方法制備提取液，平行6 次，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得丹酚酸B 含有量RSD 為0.844%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取“2.3.5” 項(xiàng)下提取液5 mL 于50 mL 量瓶中，50%乙醇稀釋至刻度，精密量取2.0 mL 于5 mL 量瓶中，共9 份，加入對(duì)照品溶液0.5、0.7、0.9 mL，配制成高、中、低質(zhì)量濃度各3 份，50%乙醇定容，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，丹酚酸B 平均加樣回收率為100.56%，RSD為1.66%。

3 結(jié)果

綜合評(píng)價(jià)［6-7］是運(yùn)用數(shù)學(xué)方法（包括數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法）對(duì)一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)的多個(gè)指標(biāo)信息進(jìn)行分析處理，以得到多個(gè)指標(biāo)之間的優(yōu)劣的評(píng)價(jià)方法。由于本實(shí)驗(yàn)是通過聯(lián)合提取對(duì)丹參中酚酸類和丹參酮類同時(shí)進(jìn)行提取，故丹酚酸B和丹參酮ⅡA都是重要的考察指標(biāo)，兩者權(quán)重系數(shù)均為0.5，再進(jìn)行加權(quán)求和，綜合評(píng)分=0.5×丹酚酸B 含有量／最大值+0.5×丹參酮ⅡA含有量／最大值。結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2 可知，各因素影響程度依次為C（提取時(shí)間） ＞B（料液比） ＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）。其中因素A 為K2＜K3＜K1，因素B 為K1＜K2＜K3，因素C 為K1＜K2＜K3；由表3 可知，因素B、C 有顯著差異（P＜0.05），而因素A 無顯著差異（P＞0.05），最終確定最優(yōu)工藝為A1B3C3，即先用6倍量70%乙醇超聲提取2 次，每次30 min，提取溫度50 ℃，再用30%乙醇回流提取3 次，每次90 min，料液比1 ∶10。根據(jù)上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4，可知工藝穩(wěn)定可行。

表3 方差分析

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

然后，進(jìn)行單一方法對(duì)照平行試驗(yàn)，結(jié)果見表5，可知此時(shí)丹酚酸B、丹參酮ⅡA含有量明顯低于聯(lián)合提取時(shí)。

表5 單一方法對(duì)照平行試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇提取次數(shù)3 次，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%，這樣有利于丹參酮類、酚酸類成分同時(shí)提取。單用回流提取時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)丹參酮ⅡA、丹酚酸B 含有量有明顯影響；聯(lián)合提取時(shí)，該因素?zé)o明顯影響，其原因可能是70%乙醇超聲提取時(shí)已將兩者部分提取出，再用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇回流提取后即無明顯差異。

前期研究［8-14］大多僅以水溶性的酚酸類成分或脂溶性的丹參酮類成分為指標(biāo)來優(yōu)化丹參提取工藝，并均采用單一提取方法；本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考慮上述2 種成分，并采用聯(lián)合提取，發(fā)現(xiàn)該方法穩(wěn)定可行，兩者含有量較高，而且有利于質(zhì)量控制，提高藥材利用率，降低生產(chǎn)成本，為實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。另外，由于丹參有效成分的提取方法很多，而本實(shí)驗(yàn)僅選擇超聲、回流聯(lián)合提取，故對(duì)其他提取方法的聯(lián)合效果尚有待于進(jìn)一步研究。