王紅芳， 李國川， 陳層層， 桑雨梅， 徐貴濤， 施 靖

（1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊050200；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊050011）

利肝隆顆粒收載于2015 年版《中國藥典》 一部［1］，是由板藍(lán)根、黃芪、茵陳、當(dāng)歸、郁金等8 味藥材提取物組成的中藥復(fù)方制劑，功效疏肝解郁、清熱解毒，用于急、慢性肝炎，遷延性肝炎等肝臟疾病，方中揮發(fā)油有效成分多，具有降脂［2］、緩解肝內(nèi)損傷性免疫反應(yīng)［3］、抗氧化活性［4］。在利肝隆顆粒制備過程中，揮發(fā)油用乙醇溶解后噴入干顆粒，但由于該成分不穩(wěn)定，極易氧化分解，故臨床使用前易揮發(fā)與降解，從而導(dǎo)致藥效降低。

目前，β-環(huán)糊精是一種較理想的藥物載體，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，內(nèi)部空穴親脂性強(qiáng)，適合脂溶性藥物包合，并且在水中溶解度小，安全無毒，生產(chǎn)成本低，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品行業(yè)［5-6］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過該載體對(duì)利肝隆顆粒組分揮發(fā)油進(jìn)行包合，并通過正交試驗(yàn)對(duì)其和提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為該成分穩(wěn)定性提高提供理論技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料

1.1 儀器 JJ-1A 數(shù)顯測速電動(dòng)攪拌機(jī)（金壇晨陽電子儀器廠）；FA2104B 電子分析天平（上海天美天平儀器有限公司）；BSA224S-CW 電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；QUANTA 250 掃描電鏡（FEI 香港有限公司）；D8 advanceX 射線衍射儀（德國Bruker 公司）。

1.2 試藥 郁金（產(chǎn)地廣西，批號(hào)17083001）、當(dāng)歸（產(chǎn)地廣 西， 批 號(hào) 17081301）、 茵 陳 （產(chǎn) 地 河 北， 批 號(hào)18020601） 均購自國藥樂仁堂河北藥業(yè)有限公司，由河北中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室張丹老師鑒定為正品，均符合2015年版《中國藥典》 一部規(guī)定。β-環(huán)糊精（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)B4147）。石油醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)160408）。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取工藝

2.1.2 工藝優(yōu)化 通過預(yù)試驗(yàn)及查閱文獻(xiàn)［9-11］，選擇加水量（A）、藥材粒度（B）、蒸餾時(shí)間（C） 作為影響因素，揮發(fā)油收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)因素3 個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)。 因素水平、 結(jié)果、 方差分析分別見表1～3。

由表3 可知，各因素影響程度依次C（蒸餾時(shí)間） ＞A（加水量） ＞B（藥材粒度），其中因素A、C 具有顯著影響（P＜0.05），而因素B 無顯著影響（P＞0.05）。結(jié)合表2 得出最優(yōu)工藝為A3B1C3，即加水量12 倍，藥材粒度≥2.5目，蒸餾時(shí)間8 h。

表1 提取工藝因素水平

表2 提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 提取工藝方差分析

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)規(guī)定比例稱取3 種藥材各3 份，按“2.1.2” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得揮發(fā)油收率分別為0.59%、0.61%、0.60%，表明工藝穩(wěn)定可行。

2.2 β-環(huán)糊精包合工藝

2.2.1 包合方法 精密稱取適量β-環(huán)糊精于三口燒瓶中，加入適量純化水充分溶解，得到飽和水溶液，燒瓶置于調(diào)至規(guī)定溫度的恒溫水浴鍋中勻速攪拌，于旁邊小孔緩慢滴加等體積無水乙醇稀釋的混合揮發(fā)油，勻速攪拌至規(guī)定時(shí)間后停止，轉(zhuǎn)移至具塞三角瓶中，放冷至室溫后冰箱中冷藏24 h，抽濾，濾餅用純化水洗滌3 次，再用3 倍揮發(fā)油量的無水乙醇分次洗滌，45 ℃恒溫通風(fēng)干燥，即得白色粉末狀包合物。

2.2.2 包合物實(shí)際含油量測定 精密量取混合揮發(fā)油200 μL，置于干燥至恒重的稱量瓶中，精密稱定揮發(fā)油質(zhì)量，計(jì)算密度，重復(fù)3 次，測得密度為0.898 3 g／mL。精密稱取干燥后的包合物，加500 mL 純化水至圓底燒瓶中，按“2.1.1” 項(xiàng)下方法測定，對(duì)所得包合物進(jìn)行水蒸氣蒸餾回收提取，加熱使其沸騰并保持微沸狀態(tài)2 h，收集揮發(fā)油［12］，精密稱定，得實(shí)際含油量。

2.2.3 空白回收率測定 精密量取揮發(fā)油0.5 mL，稱取適量β-環(huán) 糊 精 加 入 圓 底 燒 瓶 中， 加500 mL 水， 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法測定，加熱沸騰并保持微沸狀態(tài)2 h，回收揮發(fā)油，計(jì)算空白回收率，公式為空白回收率= （實(shí)際測得揮發(fā)油質(zhì)量／蒸餾前投入揮發(fā)油質(zhì)量） ×100%，平行3次，測得3 個(gè)比例（1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10） 揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的平均空白回收率分別為 95.20%、 95.50%、94.91%，無明顯差異，故選擇95.20%。

2.2.4 工藝優(yōu)化 通過單因素試驗(yàn)及查閱文獻(xiàn)［13-14］，選擇包合溫度（A）、攪拌時(shí)間（B）、揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例（C） 作為影響因素，包合物含油率［（包合物中揮發(fā)油質(zhì)量／包合物總質(zhì)量） ×100%］、收率［（包合物質(zhì)量／環(huán)糊精和投入揮發(fā)油質(zhì)量總和） ×100%］、包合率［（包合物中揮發(fā)油質(zhì)量／投入揮發(fā)油質(zhì)量與空白回收率之比） ×100%］ 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算綜合評(píng)分，公式為綜合評(píng)分=包合物含油率×0.2+包合物收率×0.2+包合率×0.6。因素水平、結(jié)果、方差分析分別見表4～6。

表4 β-環(huán)糊精包合工藝因素水平

表5 β-環(huán)糊精包合工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 β-環(huán)糊精包合工藝方差分析

由表6 可知，各因素影響程度依次為B（攪拌時(shí)間） ＞C（揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例） ＞A（包合溫度），其中因素B 有顯著影響（P＜0.05），而因素A、C 無顯著影響（P＞0.05）。結(jié)合表5 得出最優(yōu)工藝為A1B3C1，即包合溫度35 ℃，攪拌時(shí)間90 min，揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例為1 ∶6。

其次，開始時(shí)對(duì)科研成果轉(zhuǎn)化的獎(jiǎng)勵(lì)范圍可以適當(dāng)放寬，鼓勵(lì)大家積極轉(zhuǎn)化。當(dāng)科研成果的質(zhì)量越來越好、成果轉(zhuǎn)化率有所提高后，可逐步縮小獎(jiǎng)勵(lì)范圍，建立優(yōu)質(zhì)、精品獎(jiǎng)勵(lì)導(dǎo)向，引導(dǎo)大家將成果轉(zhuǎn)化越做越好、越做越精。同時(shí)，可隨著學(xué)校發(fā)展需求，適度調(diào)整獎(jiǎng)勵(lì)方向，重點(diǎn)獎(jiǎng)勵(lì)需要重點(diǎn)發(fā)展的學(xué)科方向。

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.2.4” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備3 批β-環(huán)糊精包合物，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得包合物含油率、收率、包合 率 分 別 為14.95%、 80.02%、 89.12%， 綜 合 評(píng) 分72.47，表明工藝穩(wěn)定可行。

2.3 包合物表征

2.3.1 TLC 法 稱取包合物、β-環(huán)糊精各0.1 g，加入1.0 mL無水乙醇超聲15 min，離心，取上層澄清液，作為供試液a、b；精密稱取揮發(fā)油0.1 mL，無水乙醇等體積稀釋溶解，作為供試液c；常溫下將揮發(fā)油與β-環(huán)糊精混合，加入5 mL 無水乙醇超聲溶解15 min，離心取上層澄清液，作為供試液d；取適量包合物，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，收集后精密量取0.1 mL，無水乙醇等體積稀釋溶解，作為供試液e。精密量取上述5 種供試液各10 μL，于硅膠G 薄層板點(diǎn)樣，揮干無水乙醇后置于展開缸，以石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1） 混合液為展開劑展開，取出，晾干，噴5%香草醛濃硫酸溶液顯色，105 ℃下烘干至斑點(diǎn)清晰［15-17］，結(jié)果見圖1。

圖1 包合物TLC 色譜圖

由圖可知，在包合物、β-環(huán)糊精中未見明顯斑點(diǎn)，而在β-環(huán)糊精與揮發(fā)油混合物、揮發(fā)油、包合物中回收揮發(fā)油中斑點(diǎn)分布位置幾乎一致，表明β-環(huán)糊精對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合后形成新物相，同時(shí)也表明包合工藝并未改變揮發(fā)油化學(xué)性質(zhì)。

2.3.2 顯微法 在顯微鏡下觀察β-環(huán)糊精、包合物、物理混合物，結(jié)果見圖2。由圖可知，β-環(huán)糊精在顯微鏡下呈清晰的柱狀、板塊狀結(jié)晶；包合物為不透明團(tuán)狀物，未見明顯油狀物；物理混合物中結(jié)晶與揮發(fā)油的細(xì)小油滴共存，表明其物相未發(fā)生改變，也未形成新物質(zhì)，只是簡單的物理混合。

圖2 樣品顯微鏡圖（×100）

然后，通過掃描電鏡觀察β-環(huán)糊精、包合物形態(tài)學(xué)特征，見圖3。由圖可知，β-環(huán)糊精呈柱狀、板塊狀結(jié)晶型，表面相對(duì)光滑，成像清晰；包合物為不透明團(tuán)狀物，表面相對(duì)粗糙，晶粒粒度變小，在晶型上發(fā)生了明顯變化。

圖3 樣品掃描電鏡圖

2.3.3 X 射線衍射法 條件為光源銅靶，波長0.154 18 nm，電壓-40 kV，掃描速率-5°／min，掃描范圍2θ 4°～60°，對(duì)β-環(huán)糊精、包合物進(jìn)行分析，以掃描角度為橫坐標(biāo)，衍射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，通過Origin 軟件繪制X 射線衍射圖［18-19］，結(jié)果見圖4。由圖可知，包合物衍射圖譜整體峰形和出峰角度與β-環(huán)糊精相似，但在2θ 為7°～7.5°、10°～11°、14°～16°、20°～22°、22°～33°、36°～37°、39°～40°、42°～45°、48°～48.5°等多處有新的衍射峰出現(xiàn)或峰形發(fā)生裂變，結(jié)合圖1 表明生成了新晶形，即包合物成功生成。

圖4 樣品X 射線衍射圖

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將郁金、當(dāng)歸、茵陳進(jìn)行粉碎，得到2.5 目顆粒后提取揮發(fā)油，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如果飲片（其中郁金、當(dāng)歸為市售飲片，不經(jīng)粉碎處理） 直接提取時(shí)，在相同水蒸氣蒸餾時(shí)間下?lián)]發(fā)油提取量較低，可能與飲片粒度大、內(nèi)部揮發(fā)油成分難以釋放有關(guān)；若將郁金、當(dāng)歸直接粉碎成40目以上細(xì)粉后再進(jìn)行提取，雖然提取時(shí)間縮短，但在粉碎過程中揮發(fā)油有損失，并且在提取時(shí)容易出現(xiàn)爆沸、粉末焦糊固結(jié)在瓶底等情形，同時(shí)產(chǎn)生揮發(fā)油粘壁現(xiàn)象，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取量也較低，其原因可能是由于藥材粉末過細(xì)時(shí)，加熱后于水中極易形成糊狀，粘連沉在水底，易出現(xiàn)焦糊、爆沸，并直接導(dǎo)致?lián)]發(fā)油不易被水蒸氣帶出，故最終確定提取工藝正交實(shí)驗(yàn)中將粒度分為≥2.5、≥12、≥20 目。另外，在揮發(fā)油提取器中加入一定量石油醚來收集揮發(fā)油，等到石油醚完全揮干后再進(jìn)行精密稱定，可解決微量揮發(fā)油直接讀數(shù)不準(zhǔn)確的缺陷。

在包合物制備過程中攪拌時(shí)間延長時(shí)，可在一定范圍內(nèi)提高包合物包合率，同時(shí)包合溫度升高，反應(yīng)速度加快，生成包合物量也越大，但溫度過高，部分揮發(fā)油揮發(fā)，包合率反而下降；溫度過低，β-環(huán)糊精溶解度下降，包合物生成減少。因此，控制一定溫度時(shí)既能保證β-環(huán)糊精溶解度，使揮發(fā)油與其充分接觸，又可避免高溫下攪拌后揮發(fā)油逸出，從而提高包合率。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利肝隆顆粒組方揮發(fā)油最佳提取工藝為藥材粒度≥2.5 目（孔徑7.9 mm），加水量12 倍，蒸餾時(shí)間8 h；最佳包合工藝為包合溫度35 ℃，攪拌時(shí)間90 min，揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例1 ∶6，TLC、顯微鏡、掃描電鏡、X 射線衍射表征顯示其已成功形成，而且包合狀態(tài)良好。同時(shí)，該方法操作方便，儀器簡單，實(shí)用性強(qiáng)，有利于利肝隆顆粒工藝改進(jìn)，對(duì)提高該制劑中揮發(fā)油的穩(wěn)定性有著積極意義。