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        UPLC 法測定不同海拔及不同采收期烏梅中枸櫞酸和蘋果酸

        2019-07-23 11:42:40楊正明
        中成藥 2019年6期
        關(guān)鍵詞:蘋果酸采收期烏梅

        群 培, 翟 雪,2, 金 乾, 楊正明,3?, 劉 圓

        (1.西南民族大學藥學院,四川 成都610041;2. 四川省廣安市岳池縣農(nóng)業(yè)局,四川 廣安638300;3.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,四川 成都611130;4.西南民族大學民族醫(yī)藥研究院,四川 成都610041)

        烏梅為薔薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc. 的干燥近成熟果實。始記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2],其味酸, 性平無毒, 歸肝、 脾、肺、大腸經(jīng)[3-4],有斂肺、澀腸、生津、安蛔、增強機體的免疫功效。用于治療肺虛久咳、久瀉久痢、虛熱煩渴、便血尿血等癥[4-7],在我國中藥及民族藥中已廣泛使用。關(guān)于烏梅的入藥形式,歷代本草及相關(guān)標準記載中均有去核和連核使用2 種,現(xiàn)代相關(guān)研究證明烏梅中的有效成分有機酸及水浸出物大多集中在果肉中,核中含有量甚少[8]。烏梅除作藥物使用外,還可制作果脯、飲料等,是國家公布的1 種重要的藥食兩用傳統(tǒng)藥材,也被廣泛應(yīng)用于清咽類保健食品中[9-11]。

        烏梅除含有氨基酸、黃酮、揮發(fā)油、生物堿、甾醇類外,還含有豐富的有機酸[12-13],如枸櫞酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸、乳酸、草酸等,具有軟化血管、 防老抗衰、 抗菌、 抗變態(tài)反等作用[14-15]。臨床用于肺虛久咳、久痢滑腸、虛熱消渴、蛔厥腹痛等癥[16]。多年以來,歷版《中國藥典》 對烏梅藥材的優(yōu)劣鑒別多以有機酸(以枸櫞酸計) 含有量為質(zhì)量控制指標,并且課題組前期研究發(fā)現(xiàn),烏梅中有機酸含有量最多為枸櫞酸和蘋果酸,為其主要成分,具有抑菌、抗驚厥、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化、止血、降低血脂和降血糖等多種藥理作用[17-19]。 王璐等[16,20]研究表明降血糖作用與烏梅中的蘋果酸和枸櫞酸有關(guān)。枸櫞酸廣泛應(yīng)用于食品飲料、醫(yī)藥化工、清洗與化妝品、有機材料等領(lǐng)域,是目前世界上需求最大的有機酸;蘋果酸廣泛分布于動物、植物及微生物細胞中,具有抗疲勞、改善記憶力、保護心臟等作用,同時在食品領(lǐng)域也發(fā)揮著巨大作用。本研究建立UPLC 法測定不同海拔、不同采收期烏梅果實(去核) 中蘋果酸和枸櫞酸的含有量,以期為其臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)以及食用方面提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器與試劑 Waters Acquity UPLC?H-Class

        超高效液相色譜儀(美國Waters 公司);Milli-Q 超純水機(美國Millipore 公司);DHG-9246A 型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司);JY-02 多功能粉碎機(永康浩瀚工貿(mào)有限公司);METTLER TOLEDO TYPE AE240S 電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多儀器 (上海) 有限公司];KQ-5200E 型超聲波清洗器(40 kHz、250 W,昆山超聲儀器有限公司)。

        枸櫞酸對照品(批號MUST-14091701)、蘋果酸對照品(批號MUST-14100803) 均購于成都曼思特生物科技有限公司;乙腈為色譜純(美國迪馬公司);水為超純水;其余試劑均為分析純。

        1.2 藥材 梅果實樣品采集于四川省阿壩藏族羌族自治州金川縣,經(jīng)西南民族大學劉圓教授鑒定為薔薇科植物梅Prunus mume(Sieb.) Sieb. et Zucc.的果實,見表1。樣品經(jīng)去核、烘干粉碎后,過2號篩,備用。

        表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 ACQUITY HSS C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相乙腈-0.2%磷酸,梯度洗脫,洗脫程序見表2;體積流量0.2 mL/min;檢測波長210 nm;進樣量1 μL;柱溫35 ℃。分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液進樣,色譜圖見圖1。

        表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

        2.2 溶液制備與標準曲線繪制

        2.2.1 對照品溶液制備 分別稱取枸櫞酸、蘋果酸對照品適量,精密稱定,甲醇溶解定容至10 mL量瓶 中, 即 得2.056、 2.020 mg/mL 的 對 照 品母液。

        2.2.2 供試品溶液制備 取0.5 g 干燥至恒定質(zhì)量的梅果實(去核) 粉末,精密稱定,加入20 mL 80%甲醇溶液,超聲提取100 min,搖勻,過濾,取續(xù)濾液5 mL,減壓回收溶劑至干,殘渣用少量甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶,經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾,即得。

        2.2.3 標準曲線繪制 分別精密吸取枸櫞酸和蘋果酸對照品母液,用甲醇稀釋,并定容至2 mL,得系列質(zhì)量濃度的對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下,以進樣量為橫坐標(X)、記錄色譜峰峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,以信噪比S/N=3作 為 檢 出 限 (LOD), S/N=10 作 為 定 量 限(LOQ),結(jié)果見表3。

        圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

        表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

        2.3 方法學考察

        2.3.1 精密度試驗 取同一蘋果酸和枸櫞酸混合對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下連續(xù)進樣6次,測得峰面積RSD 分別為0.82%、0.90%,表明該儀器精密度良好。

        2.3.2 重復(fù)性試驗 稱取同一烏梅果實(去核)粉末(S1)6 份,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣,記錄峰面積,得枸櫞酸、蘋果酸含有量RSD 分別為0.88%、0.78%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.3.3 穩(wěn)定性試驗 稱取烏梅果實(去核) 粉末(S1),按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下,分別于1、3、5、7、12、24 h進樣,得枸櫞酸、蘋果酸含有量RSD 分別為1.44%、1.35%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.3.4 加樣回收率試驗 取已知含有量的梅果實(去核) 粉末 (S1) 0.01 g,精密稱定6 份,加入適量枸櫞酸和蘋果酸對照品溶液,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下測定,計算回收率,結(jié)果見表4。

        表4 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.4 Results of recovery tests for various constituents(n=6)

        2.4 樣品含有量測定 精密稱取梅果實(去核)不同海拔、不同采收期樣品粉末(過4 號篩) 各0.5 g,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進行測定,計算枸櫞酸和蘋果酸的含有量,結(jié)果見表5,不同海拔、不同采收期的烏梅果實中枸櫞酸和蘋果酸含有量變化趨勢見圖2~3。

        表5 樣品中枸櫞酸和蘋果酸含有量測定n=3)Tab.5 Determination of citric acid and malic acid content in the fruits of samples

        表5 樣品中枸櫞酸和蘋果酸含有量測定n=3)Tab.5 Determination of citric acid and malic acid content in the fruits of samples

        編號 枸櫞酸 蘋果酸 總和S1 103.68±0.02 114.68±0.17 218.36±0.19 S2 108.96±0.05 121.96±0.09 230.92±0.14 S3 114.79±0.12 116.79±0.02 231.58±0.14 S4 116.35±0.07 113.35±0.09 229.70±0.16 S5 143.31±0.04 154.68±0.11 297.99±0.15 S6 159.96±0.06 148.96±0.12 308.92±0.18 S7 167.79±0.18 138.79±0.04 306.58±0.22 S8 168.35±0.06 131.35±0.05 299.70±0.11 S9 144.21±0.05 156.12±0.13 300.33±0.18 S10 153.28±0.02 150.31±0.07 303.59±0.09 S11 164.55±0.14 140.29±0.05 304.84±0.19 S12 162.22±0.05 132.45±0.11 294.67±0.16 S13 146.73±0.02 155.72±0.23 302.45±0.25 S14 155.46±0.04 149.24±0.08 304.7±0.12 S15 167.35±0.13 140.05±0.02 307.4±0.15 S16 165.03±0.06 134.93±0.09 299.96±0.15 S17 149.18±0.01 154.83±0.15 304.01±0.16 S18 158.37±0.09 148.54±0.13 306.91±0.22 S19 168.95±0.17 141.17±0.04 310.12±0.21 S20 166.44±0.08 136.43±0.10 302.87±0.18 S21 147.99±0.02 152.56±0.14 300.55±0.16 S22 156.87±0.09 146.22±0.05 303.09±0.14 S23 167.71±0.15 140.33±0.08 308.04±0.23 S24 164.40±0.05 137.14±0.03 301.54±0.08 S25 148.11±0.03 151.96±0.19 300.07±0.22 S26 157.08±0.05 144.27±0.05 301.35±0.1 S27 167.54±0.12 139.83±0.06 307.37±0.18 S28 164.32±0.03 136.74±0.05 301.06±0.08

        圖2 不同采收期樣品中枸櫞酸和蘋果酸含有量變化趨勢Fig.2 Variation tendency of citric acid and malic acid in samples from different gathering periods

        3 討論與結(jié)論

        圖3 不同海拔和不同采收期樣品中枸櫞酸和蘋果酸含有量變化趨勢Fig.3 Variation tendency of citric acid and malic acid in samples from different altitudes and different gathering periods

        本實驗采用UPLC 法對不同海拔、不同采收期的烏梅中枸櫞酸和蘋果酸進行含有量測定,結(jié)果表明海拔2 920 m 的樣品中兩者含有量明顯低于海拔小于2 400 m 的樣品;海拔2 920 m 的樣品中枸櫞酸含有量為103.68 ~116.35 mg/g,低于藥典規(guī)定的“不得小于12.0%”,而海拔低于2 400 m 的樣品中枸櫞酸含有量遠高于藥典要求;從5 月至8月,樣品中枸櫞酸含有量隨著月份的增加呈上升趨勢并趨于平衡,而蘋果酸的含有量隨著月份的增加呈下降趨勢。課題組前期查閱相關(guān)文獻得,這2 種有機酸與烏梅藥理作用關(guān)系密切,可將其列入烏梅及其制劑質(zhì)量標準控制的項目。藥理作用極其廣泛,化學成分也十分復(fù)雜,早期果實(去核) 中枸櫞酸含有量低于蘋果酸,隨著果實成熟,枸櫞酸的含有量呈逐漸增加趨勢,至后期枸櫞酸含有量略高于蘋果酸[18-20]。對枸櫞酸和蘋果酸含有量而言,烏梅栽種在海拔2 400 m 以下的地區(qū)為宜,且以7至8 月采收期為最佳。

        課題組分別考察了加熱回流和超聲提取,結(jié)果表明超聲提取效果優(yōu)于加熱回流提取,故采用超聲提?。环謩e考察了甲醇、水、乙醇3 種不同溶劑的提取效果,結(jié)果表明以甲醇作為提取溶劑,枸櫞酸和蘋果酸含有量總和最高,故選擇甲醇作為提取溶劑;分別考察不同體積分數(shù)(50%~100%) 甲醇的提取效果,結(jié)果表明甲醇體積分數(shù)為80%時,枸櫞酸和蘋果酸含有量總和最高,故選擇80%甲醇;分別考察了不同料液比(1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50) 的提取效果,結(jié)果表明料液比為1 ∶40 時,枸櫞酸和蘋果酸含有量總和最高,故選擇料液比為1 ∶40;分別考察了超聲30、60、80、100、120 min 的提取效果,結(jié)果表明當超聲時間100 min 時,枸櫞酸和蘋果酸含有量總和最高,故選擇超聲時間100 min。結(jié)合多方法學考察,表明該方法準確穩(wěn)定,重復(fù)性好,可用于烏梅的質(zhì)量控制。

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