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        泥附子商品等級(jí)劃分合理性分析

        2019-07-23 11:42:32賀亞男林俊芝張定堃
        中成藥 2019年6期
        關(guān)鍵詞:扭體甲酰個(gè)頭

        李 潘, 賀亞男, 羅 杰, 裴 瑾,2, 林俊芝, 楊 明, 張定堃,2?

        (1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,四川成都611137;2.四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司,四川 西昌615000;3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都610072;4.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌330004)

        商品規(guī)格等級(jí)是中藥品質(zhì)的重要外觀標(biāo)志,也是中藥材“辨狀論質(zhì)” “看貨評(píng)級(jí),分檔議價(jià)” 的重要指標(biāo),在中藥材市場(chǎng)流通領(lǐng)域具有不可替代的作用 [1-3]。為此,1984 年頒布了《七十六種藥材商品規(guī)格》,為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與市場(chǎng)流通起到重要作用。然而,中藥材生產(chǎn)方式發(fā)生了重大變化,栽培品大量取代野生品成為市場(chǎng)供應(yīng)主流來(lái)源。同時(shí),現(xiàn)代理化分析技術(shù)不斷發(fā)展與普及應(yīng)用,傳統(tǒng)中藥材商品規(guī)格的科學(xué)性也備受質(zhì)疑[4-7]。因此,有必要對(duì)中藥材商品規(guī)格等級(jí)劃分的合理性進(jìn)行再認(rèn)識(shí)與再評(píng)價(jià)。

        附子是毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根,是確有療效的有毒中藥。其毒烈,不少醫(yī)家避之如蛇蝎,終生不敢使用;其效彰,被譽(yù)為“回陽(yáng)救逆第一品”,治病保命“藥中四維”[8-9]。因此,研究影響附子毒效的因素是藥材品質(zhì)優(yōu)良,用藥安全的重要保障。

        關(guān)于附子的品質(zhì),從宋代起就有評(píng)價(jià)方法的論述。 《彰明附子記》 中記載,泥附子一般以“底平”“體圓” “皮黑” “肉花白” “八角” 或“九角” 者為佳;在質(zhì)量上, “一個(gè)重一兩,即是氣全,堪用”。近幾十年來(lái),關(guān)于泥附子感官評(píng)價(jià)的指標(biāo)趨于簡(jiǎn)化,如《七十六種藥材商品規(guī)格》主要以質(zhì)量為評(píng)價(jià)[10-12]。在產(chǎn)地,附子收獲后也按照個(gè)頭大小分檔銷售、加工炮制。大附子用于加工炮天雄,作為溫腎助陽(yáng)之佳品;中等個(gè)頭附子用于加工白附片、黑順片等,作為附子的主流飲片規(guī)格;小個(gè)頭附子直接干燥后充當(dāng)川烏,作為祛風(fēng)濕止痛藥。因此,深入探討個(gè)頭大小對(duì)附子毒效的影響規(guī)律,對(duì)于研究商品規(guī)格等級(jí)的合理性與科學(xué)性,指導(dǎo)附子種植、采收、良種選育、市場(chǎng)流通與臨床應(yīng)用均具有重要意義。

        1 材料

        1.1 藥材 泥附子于2017 年6 月27 日采集于四川省江油市橋樓村GAP 種植基地的同一地塊,根據(jù)個(gè)頭大小,將附子分為5 個(gè)等級(jí),分別為Ⅰ等0 g<質(zhì)量<20 g、Ⅱ等20 g<質(zhì)量<40 g、Ⅲ等40 g<質(zhì)量<60 g、Ⅳ等60 g <質(zhì)量<80 g、Ⅴ等質(zhì)量>80 g。樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院裴瑾教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根,外觀性狀見(jiàn)圖1。樣品洗凈、切片、冷凍干燥,粉碎過(guò)2 號(hào)篩,備用。阿司匹林腸溶片,由拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn),批號(hào)J20171021,使用前用0.5%CMC-Na 溶液配成阿司匹林混懸液。

        圖1 不同等級(jí)樣品外觀性狀Fig.1 Appearances of different grades of samples

        1.2 試劑 烏頭堿、新烏頭堿、印烏頭堿、次烏頭堿、烏頭原堿、尼奧林、松果林、塔拉烏頭胺對(duì)照品均購(gòu)于成都曼斯特生物有限公司,批號(hào)分別為MUST-16062206、 MUST-16032504、 MUST-16101810、MUST-16032106、 MUST-16060306、 MUST-16052503、MUST-17022505、MUST-16031801; 苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、附子寧、去甲烏藥堿、去甲豬毛菜堿對(duì)照品購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司,批號(hào)分別為CHB160912、CHB151203、 CHB160326、 CHB160812、 CHB151111、CHB160922,所有對(duì)照品含有量均>98%。色譜級(jí)二甲亞砜和甲酸購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠;超純水(自制); 甲醇、 乙腈 (色譜純, 美國(guó)Fisher 公司);屈臣氏蒸餾水購(gòu)于廣州屈臣氏食品飲料有限公司;其余試劑均為分析純。

        1.3 動(dòng)物 KM 小鼠,SPF 級(jí),體質(zhì)量18 ~22 g,雌雄各半;SD 大鼠,雄性,體質(zhì)量180 ~200 g,均由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(川)2015-030,檢疫后備用。將動(dòng)物保持在溫度(20±0.5)℃,濕度(55±5)%和12 h光照和12 h 黑暗循環(huán)的受控條件下,在實(shí)驗(yàn)之前,動(dòng)物禁食24 h,可自由飲水。

        1.4 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀、Agilent 6460C 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (美國(guó)Agilent 公司);BP211 DAG 電子分析天平(德國(guó)Satorius 公司);CHRIST ALPHAI-4 LSC 冷凍干燥器(上海斯高勒生物科技有限公司);KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);SZ-93 A 自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 含有量測(cè)定

        2.1.1 供試品溶液制備 取樣品粉末各0.1 g,精密稱定,置10 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,稱定質(zhì)量,超聲提取30 min,取出,放冷,精密稱定,補(bǔ)足減失質(zhì)量,過(guò)0.22 μm 微孔濾膜,即得。

        2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別取各對(duì)照品適量,精密稱定,用甲醇配制成含14 種生物堿的混合對(duì)照品于棕色量瓶中, 質(zhì)量濃度分別為烏頭堿1.905 μg/mL、新烏頭堿10.2 μg/mL、次烏頭堿2.032 μg/mL、印烏頭堿0.464 μg/mL、苯甲酰烏頭 原 堿 0.672 μg/mL、 苯 甲 酰 新 烏 頭 原 堿1.932 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿0.18 μg/mL、烏頭原堿0.104 μg/ mL、附子寧4.32 μg/mL、尼奧林2.032 μg/mL、塔拉烏頭胺0.33 μg/mL、松果林2.904 μg/mL、去甲烏藥堿0.134 μg/mL、去甲豬毛菜堿0.416 μg/mL。儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中,備用。

        2.1.3 分析條件

        2.1.3.1 色譜條件 Phenomenex C18色譜(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0 ~1 min,2%~20%B;1 ~5 min,20%~50%B;5 ~10 min,50%~75%B;10~15 min,75%~100%B);體積流量0.45 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

        2.1.3.2 質(zhì)譜條件 采用ESI 源,正離子模式檢測(cè);脫溶劑溫度300 ℃;脫溶劑氣流N211 L/min;霧化器壓力103.425 kPa;毛細(xì)管電壓4 000 V;掃描方式為MRM 檢測(cè),14 種生物堿成分的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式信息見(jiàn)表1,MRM 色譜圖見(jiàn)圖2。

        表1 各成分多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式信息Tab.1 MRM information of various constituents

        2.1.4 方法學(xué)考察 參照ICH Q2B 技術(shù)指導(dǎo)原則進(jìn)行。取對(duì)照品溶液適量,用甲醇稀釋為不同質(zhì)量濃度梯度的對(duì)照品溶液,在擬定的HPLC-MS/MS條件下測(cè)定。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸。同時(shí)測(cè)定各待測(cè)物的定量限(S/N=10) 和檢測(cè)限(S/N=3),各成分線性關(guān)系、LOD 和LOQ 的結(jié)果見(jiàn)表2。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與加樣回收率前期已研究[13],表明該方法能滿足含有量測(cè)定的要求。

        表2 各成分線性關(guān)系、LOD 和LOQTab.2 Linear relationships,LOD and LOQ of various constituents

        圖2 各成分MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of various constituents

        圖3 不同等級(jí)附子的含有量測(cè)定結(jié)果Fig.3 Results of content determination of Aconite with different grades

        表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果(μg/g,n=6)Tab.3 Results of content determination of various constituents(μg/g,n=6)

        2.1.5 樣品含有量測(cè)定 取5 個(gè)不同等級(jí)的附子粉末,按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備樣品溶液,每個(gè)樣品平行制備6 份。在“2.1.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,計(jì)算各供試品溶液中14 種生物堿的含有量,結(jié)果見(jiàn)表3??芍煌燃?jí)附子中成分含有量具有顯著差別。隨著附子質(zhì)量的增大, 雙酯型生物堿(烏頭堿、新烏頭堿、印烏頭堿) 與強(qiáng)心成分(去甲烏藥堿、去甲豬毛菜堿) 的含有量分別呈現(xiàn)降低、升高趨勢(shì),單酯型生物堿(苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿) 含有量較低,無(wú)法比較組間差異, 其余5 種藥效成分(尼奧林、塔拉烏頭胺、松果林、附子寧、烏頭原堿) 具有升高趨勢(shì),但組間差異并不明顯,見(jiàn)圖3。由此推測(cè)大個(gè)頭附子可能具有高效低毒的性能,而小個(gè)頭附子可能不僅低效,還具有大毒的藥性。因此,初步判定附子質(zhì)量分級(jí)具有一定的合理性。2.1.6 聚類分析 采用HemI 分析軟件對(duì)5 種等級(jí)附子的含有量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)14 種生物堿含有量的差異,5 種等級(jí)的附子可被分為0 ~60 g 和60 ~100 g 兩類,其中0~60 g 又被分為0 ~40 g 和40 ~60 g 兩類。因此“小個(gè)頭” 附子與“大個(gè)頭” 附子中生物堿含有量是有明顯差異的,并且同一等級(jí)附子組內(nèi)差異小,證明了分級(jí)的科學(xué)性。另外,由熱圖顏色差異可知,新烏頭堿、次烏頭堿、附子寧、尼奧林、松果林的含有量高于其他生物堿,并且隨著附子等級(jí)的升高,大毒成分新烏頭堿和印烏頭堿的含有量顯著降低,鎮(zhèn)痛成分尼奧林和松果林的含有量明顯升高,進(jìn)一步認(rèn)為“小個(gè)頭” 附子具有毒性強(qiáng)、鎮(zhèn)痛功效弱的性能。

        2.2 不同等級(jí)附子鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)[14-15]

        2.2.1 樣品制備 取5 個(gè)不同等級(jí)的附子各10 g,提取2 次,第1 次加10 倍量水,浸泡30 min 后,煎煮3 h;第2 次加8 倍量水,煎煮3 h,合并提取液,濃縮至質(zhì)量濃度0.5 g 生藥/mL。取阿司匹林腸溶片適量, 研細(xì), 用0.5% CMC-Na 配制成200 mg/kg 阿司匹林混懸液,作為鎮(zhèn)痛陽(yáng)性藥。

        圖4 各成分在不同等級(jí)附子中的平均豐度熱圖Fig.4 Thermograph of average abundance for various constituents in different grades of Aconite

        2.2.2 對(duì)小鼠醋酸所致扭體反應(yīng)的影響 取小鼠56 只,雌雄各半,隨機(jī)分為7 組,每組8 只。陽(yáng)性對(duì)照組給予200 mg/kg 阿司匹林混懸液,空白組給予蒸餾水10 mL/kg,附子不同等級(jí)組均按5 g 生藥/kg 灌胃給藥,1 次/d,連續(xù)3 d。于末次給藥后1 h, 給予各組小鼠腹腔注射0.6% 冰醋酸10 mL/kg,立即計(jì)時(shí),記錄小鼠首次出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時(shí)間作為潛伏期,同時(shí)記錄每只小鼠造模后15 min 內(nèi)出現(xiàn)的扭體次數(shù),結(jié)果見(jiàn)表4??芍?,與空白組相比,陽(yáng)性組與附子組對(duì)小鼠醋酸所致扭體反應(yīng)的影響存在顯著差異,并且陽(yáng)性組療效優(yōu)于附子各組。但是,附子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組扭體次數(shù)無(wú)組間差異,其療效無(wú)顯著差別。另外,陽(yáng)性組相比于空白組顯著增大了小鼠扭體潛伏期,附子組無(wú)顯著性影響,而隨著附子等級(jí)的升高,存在降低趨勢(shì),表明“小個(gè)頭” 附子可能具有延長(zhǎng)小鼠扭體潛伏期的效果。

        2.3 不同等級(jí)附子最小致死量的測(cè)定[16-17]

        2.3.1 樣品制備 取不同等級(jí)附子粉末2 g,精密稱定, 用20 mL 70%乙醇超聲提取30 min。在5 000 r/min的條件下離心10 min,分離上清液。取1 mL 上清液, 加入19 mL 生理鹽水稀釋, 經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾,得測(cè)試溶液。精密稱定烏頭堿對(duì)照品適量, 溶解在無(wú)水乙醇中, 配成200 μg/mL溶液,在測(cè)定當(dāng)天用生理鹽水稀釋配成10 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        表4 不同等級(jí)附子對(duì)小鼠醋酸所致扭體反應(yīng)的影響n=8)Tab.4 Effects of Aconite with different grades on writhingresponse caused by acetic acid in mice

        表4 不同等級(jí)附子對(duì)小鼠醋酸所致扭體反應(yīng)的影響n=8)Tab.4 Effects of Aconite with different grades on writhingresponse caused by acetic acid in mice

        注:與空白組比較,?P<0.01

        陽(yáng)性組組別 7潛.7伏2±期3./7m2i?n扭3.體50次±2數(shù).5/6次?附子Ⅰ組 5.24±0.98 15.00±3.89?附子Ⅱ組 4.96±1.02 13.38±3.93?附子Ⅲ組 4.58±1.00 12.62±6.21?附子Ⅳ組 4.46±1.27 14.38±5.01?附子Ⅴ組 4.27±0.73 12.00±4.50?空白組 3.89±0.60 26.12±3.94

        2.3.2 對(duì)大鼠最小致死量測(cè)定 取大鼠36 只,隨機(jī)分為6 組,每組6 只。實(shí)驗(yàn)時(shí),將每只動(dòng)物固定,并將標(biāo)準(zhǔn)溶液或測(cè)試溶液通過(guò)緩慢推注入大鼠尾靜脈中,確保藥物作用迅速,直到動(dòng)物死亡。以瞳孔擴(kuò)張和呼吸停止視為死亡的臨界點(diǎn),記錄推注量(V) 和體質(zhì)量(m),并根據(jù)藥物濃度(c),由公式1 計(jì)算最小致死劑量(MLD),結(jié)果見(jiàn)表4。

        此實(shí)驗(yàn)以MLD 越小,代表毒性越大。見(jiàn)圖5,與烏頭堿組相比,附子組MLD 顯著升高,毒性降低。附子Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組MLD 高于附子Ⅰ、Ⅱ組,即毒性小于Ⅰ、Ⅱ組。另外,附子Ⅲ和Ⅴ組與其他3 組比較具有顯著性差異,其MLD 升高,表現(xiàn)出低毒,而附子Ⅲ組MLD 最高,可能與其毒性成分含有量低有關(guān)。并且發(fā)現(xiàn)隨著附子等級(jí)的升高,MLD 具有升高趨勢(shì),毒性存在降低趨勢(shì),但組間差異并不明顯。因此,附子等級(jí)的差異與毒性在一定程度上具有相關(guān)性,進(jìn)一步證明了分級(jí)的合理性。

        3 討論

        圖5 不同等級(jí)附子對(duì)大鼠最小致死量的測(cè)定結(jié)果(n=6)Fig.5 Results of determination of the MLD in rats with different grades of Aconite(n=6)

        本研究以化學(xué)分析為基礎(chǔ),探討不同等級(jí)附子間的毒效關(guān)系,并以藥效與毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證附子分級(jí)的合理性。通過(guò)化學(xué)分析,14 種生物堿在不同等級(jí)附子中含有量存在顯著差異,而這種差異主要與生物堿在皮部、髓部的分布差異和累積規(guī)律有關(guān)[10]。附子的長(zhǎng)大增重主要是形成層內(nèi)的髓部比例增大,而形成層外的皮部與韌皮部比例相對(duì)降低。再結(jié)合新烏頭堿、次烏頭堿在皮部、髓部的含有量可知,雙酯型生物堿主要分布在形成層外的皮部與韌皮部,其含有量約為髓部的2 倍[2]。由此可知,大個(gè)頭附子中雙酯型生物堿含有量較低,主要是由髓部比例高,毒性成分含有量低決定的。并且隨著附子等級(jí)的升高,呈現(xiàn)出雙酯型生物堿降低的趨勢(shì)。而在測(cè)定最小致死量的實(shí)驗(yàn)中, “大個(gè)頭”附子具有較高M(jìn)LD,呈現(xiàn)出低毒藥性,兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互驗(yàn)證, 表明 “小個(gè)頭” 附子毒性強(qiáng)于“大個(gè)頭” 附子。

        附子的鎮(zhèn)痛療效顯著,以鎮(zhèn)痛效果驗(yàn)證附子分級(jí)的藥效研究具有代表性[18-20]。在對(duì)小鼠醋酸所致的扭體次數(shù)的影響研究中,附子水煎液與阿司匹林均具有顯著療效。然而,5 個(gè)等級(jí)附子的鎮(zhèn)痛效果在醋酸扭體實(shí)驗(yàn)中并未呈現(xiàn)出顯著差異,可能是其生物堿含有量較高,均大于附子鎮(zhèn)痛活性的最高有效劑量,因此,不同等級(jí)附子間生物堿存在的差異難以通過(guò)鎮(zhèn)痛活性反映出來(lái)。根據(jù)化學(xué)分析結(jié)果,雙酯型生物堿在小個(gè)頭附子中含有量最高,又是鎮(zhèn)痛作用的主要成分,因此,隨著附子等級(jí)的升高,小鼠扭體潛伏期存在縮短的趨勢(shì)。

        綜上,根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn),將附子按照個(gè)頭大小分檔,具有一定的合理性。不同等級(jí)附子品質(zhì)差異主要體現(xiàn)在毒性差異,而在鎮(zhèn)痛活性上差異并不明顯。因此,在充分保障附子減毒效果的前提下,可以考慮將小個(gè)頭附子加工成炮制品用于臨床,這有利于節(jié)約資源,提高藥材利用率。

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