蘭 莉

急性心肌梗死(AMI)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)的嚴重類型，是心內(nèi)科常見的疾病之一，具有發(fā)病急、致死率高的特點[1～3]。關(guān)于心肌梗死的研究已成為當(dāng)下醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點，早期診斷和治療急性心肌梗死對患者的治愈和預(yù)后至關(guān)重要[4,5]。微小RNA(miRNA)是一種長度約為18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼的單鏈小RNA[6,7]。據(jù)報道，miRNA能夠調(diào)控人類約30%的基因，且其調(diào)控模式多樣，有時一個miRNA能夠調(diào)控多種基因，有時一個基因受到多種miRNA的共同調(diào)控[8]。miRNA調(diào)控基因表達的主要方式是參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。研究表明，miRNA具有組織特異性，多種miRNA在心臟中能夠呈差異性表達，且能夠調(diào)控心肌細胞的分化、衰老、增殖、凋亡和焦亡等功能[9,10]。并且有些miRNAs在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能[11]。本研究主要探討miR-188在心肌梗死患者中的表達及臨床意義，為今后心肌梗死的治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年3月至2017年5月我院收治的經(jīng)冠狀動脈造影確診為急性心肌梗死患者的心臟組織和血清樣本20例，其中男性12例，女性8例，年齡30～72歲，平均(48.5±13.5)歲。收集同期在我院接受治療的非急性心肌梗死的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的心臟組織和血清樣本20例作為對照組，其中男性11例，女性9例，年齡30～72歲，平均(49.2±14.0)歲。兩組患者在年齡、性別、危險因素等一般資料無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究中關(guān)于急性心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會心血管分會《急性心肌梗死診斷和治療指南(2012年)》。排除標(biāo)準(zhǔn)：服用過利尿劑、嚴重感染、腫瘤、創(chuàng)傷，或患有腦、肺、肝、腎及內(nèi)分泌疾病患者。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬自愿簽署知情同意書。標(biāo)本采集后立即置于液氮或-80℃冰箱保存。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 選擇出生一天新生C57BL/6J乳鼠的心臟，分離提取心肌細胞，并采用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合物的DMEM高糖培養(yǎng)液(Corning公司，美國)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)中培養(yǎng)。當(dāng)細胞貼壁生長，且密度達到60%左右時，采用轉(zhuǎn)染試劑X-treme(Roche，德國)將miR-188轉(zhuǎn)染進心肌細胞。細胞分組分為miR-188過表達組(miR-188類似物組)、miR-188敲減組(miR-188抑制劑組)、類似物陰性對照組(類似物-NC)、抑制劑陰性對照組(抑制劑-NC)。

1.3 miR-188表達水平的檢測 采用Trizol Reagent試劑(Life technology，美國)提取心臟組織、臨床血清樣本和心肌細胞中總RNA，并檢測其濃度和純度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊，中國)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，備用。采用SYBR試劑(諾唯贊，中國)、cDNA、上游引物(吉瑪，中國)、下游引物(吉瑪，中國)、蒸餾水等試劑進行qRT-PCR。采用比較閾值法(2-△△CT法)計算miR-188相對表達量。

1.4 MTT實驗 將心肌細胞接種至96孔板(Nest，美國)中，將miR-188轉(zhuǎn)染至心肌細胞轉(zhuǎn)染24h時進行MTT實驗。首先，每孔加入20μl的MTT工作液(濃度為5mg/ml)，孵育4h后終止培養(yǎng)，每孔加入150μl的二甲基亞砜(DMSO)，37℃溫箱孵育10分鐘或搖床低速振蕩10分鐘以保證充分混合。使用酶標(biāo)儀于490nm波長處檢測每孔吸光度值(OD)，并統(tǒng)計結(jié)果。

1.5 臺盼藍實驗 心肌細胞用胰酶消化后，加入一定量的培養(yǎng)液，制成細胞懸液，每0.1ml細胞懸液約加等量新鮮配制的0.4%臺盼藍工作液，室溫下孵育5～10min，取一滴細胞懸液置載玻片上，輕輕放置蓋玻片后放倒置顯微鏡的高倍鏡下觀察，觀察到死亡的細胞呈現(xiàn)淺藍色并膨大，且無光澤；而活細胞不著色并保持正常形態(tài)，且有光澤?？砂垂接嬎愠黾毎盥?。細胞活率=未染色的細胞數(shù)/觀察的細胞總數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，用Graphpad軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料行t檢驗，計數(shù)資料行卡方檢驗，組間差異以P進行判定，當(dāng)P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 心肌梗死患者中miR-188的表達 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，與對照組患者的心臟組織相比，心肌梗死患者心臟組織中miR-188的表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0109，見圖1A)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與非對照組患者相比，心肌梗死患者血清中miR-188的表達同樣顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0065，見圖1B)。

注：*P<0.05，**P<0.01。圖1 兩組miR-188的表達

2.2 心肌細胞miR-188的轉(zhuǎn)染效率 與類似物-NC組比較，細胞轉(zhuǎn)染miR-188的類似物后，miR-188的表達水平顯著升高(P=0.0193)(圖2A)。與抑制劑-NC組比較，細胞轉(zhuǎn)染miR-188抑制劑后，miR-188的表達量顯著降低(P=0.0062，見圖2B)。

注：*P<0.05，**P<0.01。圖2 心肌細胞miR-188的轉(zhuǎn)染效率

圖3 miR-188提高心肌細胞增殖能力與存活率

2.3 miR-188提高心肌細胞增殖能力和存活率 MTT實驗結(jié)果顯示，與類似物-NC組相比，miR-188類似物顯著提高心肌細胞增殖能力，而miR-188抑制劑顯著抑制其增殖(圖3A)。臺盼藍實驗顯示，與類似物-NC組相比， miR-188類似物顯著提高心肌細胞存活率，而miR-188抑制劑顯著降低其存活率(圖3B)。

3.討論

急性心肌梗死可能與心肌細胞增殖、凋亡、衰老、死亡等密切相關(guān)[12]。目前，研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與心肌細胞生物學(xué)功能，進而參與心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)miR-188在心肌梗死患者心臟組織中表達顯著低于對照組患者中的表達，且其在心肌梗死患者血清樣本中的表達顯著低于對照組患者中的表達。在轉(zhuǎn)染miR-188類似物的心肌細胞中，miR-188的表達顯著升高，在轉(zhuǎn)染miR-188抑制劑的心肌細胞中miR-188的表達顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。MTT結(jié)果顯示，miR-188類似物顯著提高心肌細胞增殖能力，miR-188抑制劑顯著降低心肌細胞增殖能力。臺盼藍實驗結(jié)果顯示，miR-188類似物顯著升高心肌細胞存活率，而miR-188抑制劑降低心肌細胞存活率。

綜上所述，miR-188在心肌梗死患者心臟組織和血清中表達均呈現(xiàn)降低趨勢，并能夠提高心肌細胞增殖能力和存活率。因此，我們得出結(jié)論miR-188可以作為臨床診斷、預(yù)測、治療心肌梗死的生物標(biāo)記物。后續(xù)的研究中我們將探討miR-188調(diào)控心肌細胞生物學(xué)功能的分子機制，為臨床治療、診斷、預(yù)測心肌梗死提供充足的證據(jù)和理論基礎(chǔ)。