蔡勇科 吳俊賢 黎曉曲

外科舒筋洗劑在本院沿用有近20年， 是本院制劑中的拳頭制劑。該制劑療效確切， 廣泛用于臨床， 使用量逐年增長， 得到臨床和患者高度的認(rèn)可， 臨床主要用于跌打損傷、勞損、腰頸椎病、骨關(guān)節(jié)炎以及骨折恢復(fù)期等的外洗、熏蒸治療［1］。其主要由兩面針、蘇木、黃柏、荊芥、 鉤藤、透骨草、威靈仙、千年健、 北劉寄奴、寬筋藤10味中藥組成， 具有活血散瘀、舒筋通絡(luò)作用， 常用來治療跌打損傷、瘀血等。該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)蘇木、黃柏進(jìn)行定性鑒別［2］， 對(duì)于其含量檢測(cè)目前尚無標(biāo)準(zhǔn)， 導(dǎo)致無法全面有效地控制外科舒筋洗劑的質(zhì)量。黃柏在外科舒筋洗劑處方中為臣藥， 鹽酸小檗堿為黃柏主要有效成分［3］， 故本文擬探索采用高效液相色譜法建立該制劑中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定方法， 并測(cè)定外科舒筋洗劑中鹽酸小檗堿的含量［4-6］， 旨在為控制其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供客觀定量的評(píng)價(jià)方法， 提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 為日常生產(chǎn)提供檢驗(yàn)依據(jù)， 現(xiàn)具體報(bào)告如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 美國安捷倫公司Agilent-1200型高效液相色譜儀， 包括安捷倫四元泵， 安捷倫在線脫氣機(jī)， 安捷倫紫外檢測(cè)器等；安捷倫色譜柱(型號(hào)：Eclipse Plus 填料：C18)；德國賽多利期公司CP225D型(0.01 mg/0.1 mg)電子天平， 昆山市超聲儀器有限公司KQ-250DA型數(shù)控型超聲波清洗器(功率250 W， 頻率 40 kHz)。

1.2 試劑 乙腈 (色譜純， TEDIA)， 磷酸二氫鉀(廣州化學(xué)試劑廠20170701-1)， 水為超純水；鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-2011814 供含量測(cè)定用)購自中國藥品生物制品檢定所， 含量為86.7%；外科舒筋洗劑(河源市中醫(yī)院提供3批次：批號(hào) ：181001、181002、181101)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 對(duì)照樣品溶液的配制：以電子分析天平稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品10.02 mg于100 ml量瓶中, 然后加甲醇溶液將其溶解并稀釋至刻度, 作為貯備液, 精密量取貯備液5 ml于25 ml量瓶中, 同樣以甲醇溶液稀釋至刻度后即為對(duì)照樣品液；供試品溶液的配制：取外科舒筋洗劑溶液過濾后, 精密量取20 ml, 蒸干, 加甲醇溶液使其溶解(必要時(shí)可用超聲方法溶解)并轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中, 加甲醇溶液至刻度, 即得供試品溶液；陰性對(duì)照品溶液液的配制：按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方比例同法配制不含黃柏的陰性樣品,按供試品溶液配制方法配制成相應(yīng)的陰性對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件與進(jìn)樣分析 以Agilent Eclipse Plus C18(250.0 mm×4.6 mm， 5 μm)為填充柱 ， 流動(dòng)相為乙腈 -0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液 (28∶72)， 檢測(cè)波長為 347 nm， 流速為1.0 ml/min， 進(jìn)樣量為10 μl；以峰面積外標(biāo)法定量。在本色譜條件下， 外科舒筋洗劑中鹽酸小檗堿對(duì)照品的色譜峰與其他組分峰均取得較好分離， 干擾性較小。

2.3 干擾測(cè)試結(jié)果 分別取對(duì)照品溶液、樣品溶液、陰性對(duì)照液， 按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)繪高效液相色譜法圖譜， 組分的出峰時(shí)間區(qū)域相互分離， 未發(fā)現(xiàn)明顯干擾峰， 結(jié)果表明處方中其他成分及輔料對(duì)鹽酸小檗堿的測(cè)定無干擾作用。見圖1。

圖1 外科舒筋洗劑高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液 1、3、5、7、9、11 ml， 置于 25 ml量瓶中 ， 通過甲醇定容至要求刻度， 充分搖勻后得到一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述色譜條件分別進(jìn)樣 10 μl， 測(cè)定峰面積 ， 以峰面積(A)為縱坐標(biāo)， 鹽酸小檗堿對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 進(jìn)行線性回歸， 計(jì)算得回歸方程。鹽酸小檗堿A=29.63C+45.743(r=0.9912)， 結(jié)果表明鹽酸小檗堿在3.4749～38.2243 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 高效液相色譜法測(cè)定方法特性分析 取同一對(duì)照品溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣 6 次 ， 進(jìn)樣量 10 μl， 測(cè)定峰面積 ， RSD 為0.18%， 結(jié)果表明該方法使用的儀器具有良好精密度；取同一批號(hào)供試品， 精密量取6份， 按樣品測(cè)定方法平行測(cè)定含量，RSD為0.56%， 結(jié)果表明該方法重復(fù)性好；取同一樣品溶液，在室溫放置 ， 分別于 0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定 1 次 ， 連續(xù)測(cè)定6次， RSD為0.85%， 樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 精密量取已知鹽酸小檗堿含量的樣品 (批號(hào) ：181001， 鹽酸小檗堿含量 ：38.9 μg/ml)10 ml，共6份， 分別加入上述鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液(鹽酸小檗堿 ：86.9 μg/ml)100、200、300 μl， 依法制備供試品溶液 ， 按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定， 計(jì)算回收率。結(jié)果顯示， 該方法平均回收率為98.06%， RSD為0.93%。見表1。

表1 6份鹽酸小檗堿樣品加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果 取外科舒筋洗劑3批(批號(hào)：181001、181002、181101)進(jìn)行鹽酸小檗堿含量的測(cè)定 ， 按 2.1 方法進(jìn)行配制待測(cè)樣品液 ， 進(jìn)樣 10 μl， 記錄峰面積 ，以外標(biāo)法計(jì)算鹽酸小檗堿含量。3批樣品鹽酸小檗堿含量分別為 38.9、38.8、38.9 μg/ml。見表 2。

表2 3批樣品鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的確定 外科舒筋洗劑為本院院內(nèi)制劑, 具有活血散瘀、舒筋通絡(luò)之功效, 臨床用來治療跌打損傷、瘀血等疾病, 臨床應(yīng)用多年, 效果顯著。外科舒筋洗劑原標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)蘇木、黃柏進(jìn)行定性鑒別, 不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升要求,對(duì)其日常生產(chǎn)質(zhì)量也難于監(jiān)控。本試驗(yàn)曾經(jīng)嘗試對(duì)兩面針中氯化兩面針堿進(jìn)行含量［7］測(cè)定, 但供試品峰面積偏小, 考慮現(xiàn)有工藝中該成分提取率不高［8］, 故不再選擇兩面針作為研究對(duì)象。黃柏在該制劑處方中為臣藥, 其具有清熱、消腫、止痛等作用, 與兩面針等其他藥發(fā)揮活血散瘀、舒筋通絡(luò)止痛之功效。黃柏主要以鹽酸小檗堿為主要有效成分［9-15］。在上述試驗(yàn)條件下, 經(jīng)試驗(yàn)證實(shí), 鹽酸鹽酸小檗堿試驗(yàn)分離度和重復(fù)性較好, 且陰性無干擾, 故選擇其為研究對(duì)象。

3.2 檢測(cè)波長的選擇 經(jīng)在線全波長紫外吸收光譜掃描分析, 鹽酸小檗堿在265 nm和347 nm波長處有最大吸收波長。若采用265 nm作為檢測(cè)波長時(shí), 鹽酸小檗堿的分離效果較差,分離度達(dá)不到要求［16,17］；而采用347 nm作為檢測(cè)波長時(shí),鹽酸小檗堿的分離度好, 峰形良好。且其他物質(zhì)對(duì)測(cè)定無干擾。最終采用347 nm作為檢測(cè)波長。

3.3 提取條件的選擇 提取方法可選取甲醇、甲醇-鹽酸(100∶1)兩種溶劑分別進(jìn)行提取, 結(jié)果并無明顯差別, 但從操作方法的簡(jiǎn)便方面考慮, 選取甲醇提取鹽酸小檗堿［18-21］。

3.4 流動(dòng)相的選擇 作者曾對(duì)不同流動(dòng)相體系條件的實(shí)驗(yàn)效果分別進(jìn)行了考察, 分別比較乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 ml加十二烷基磺酸鈉0.1 g)及乙腈-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相的效果, 結(jié)果表明, 兩者結(jié)果并無明顯差別, 從操作方法的簡(jiǎn)便及環(huán)境保護(hù)方面考慮, 選取乙腈-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相。

3.5 不同批次樣品的含量測(cè)定 通過對(duì)不同時(shí)間生產(chǎn)3批外科舒筋洗劑進(jìn)行鹽酸小檗堿含量的測(cè)定, 結(jié)果顯示差異小, 說明該制劑生產(chǎn)工藝穩(wěn)定, 在制訂內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)或者提高該制劑標(biāo)準(zhǔn), 可暫定外科舒筋洗劑的黃柏以鹽酸小檗堿計(jì),≥30 μg /ml。

綜上所述， 本研究建立測(cè)定外科舒筋洗劑中鹽酸小檗堿含量方法， 經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證， 所建立的測(cè)定方法符合定量分析要求， 最終確定以347 nm為檢測(cè)波長， 甲醇為提取液， 乙腈-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相， 測(cè)定結(jié)果顯示該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、分離度好， 重復(fù)性好， 干擾小， 可用于外科舒筋洗劑的質(zhì)量控制。