宋巖 仲一 付凌姣 王海濱

《手足口病診療指南》(2010版)中手足口病(hand-food-mouth disease,HFMD)常規(guī)病原學(xué)檢測只對腸道病毒通用型、腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)和柯薩奇病毒A組l6型(coxsackievirus A16，CVAl6)核酸進(jìn)行熒光定量PCR檢測[1]，對于引起HFMD的其它非EV71非CVA16型腸道病毒(untyped enterovirus, EV-U)型別未做明確鑒定，為全面了解北京市朝陽區(qū)腸道病毒的病原構(gòu)成，對2016年度的EV-U分析報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 2016年朝陽區(qū)醫(yī)療機構(gòu)的咽拭子或糞便標(biāo)本；標(biāo)本采集后，4 ℃暫存，12 h內(nèi)送達(dá)實驗室，需長期保存的標(biāo)本存于-70 ℃冰箱。

1.2方法

1.2.1EV的Real-time PCR檢測： 使用Thermo核酸提取儀進(jìn)行病毒RNA提取，采用上海之江公司EV71型、CVAl6型及腸道病毒通用型核酸聯(lián)合檢測試劑盒進(jìn)行檢測。腸道病毒通用型核酸陽性且EV71型和CVA16型腸道病毒核酸陰性的標(biāo)本確定為EV-U核酸陽性標(biāo)本，作為本次的研究對象。

1.2.2非EV71非CVAA16型EV的PCR檢測： 參考以往研究[2]，對EV基因組的5’端非編碼區(qū)(5’UTR)和VP2基因區(qū)分別設(shè)計特異引物。

1.2.3CVA10的完整VP1基因片段測序及分析： 設(shè)計完整VP1基因(894 bp)特異性引物。使用Vector NTI Suite 6和Clustalx軟件剪切出完整VP1基因；將本研究的CVA10及來自NCBI數(shù)據(jù)庫的完整VP1基因?qū)隡EGA 6進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1EV病原譜結(jié)果 檢測標(biāo)本875份，檢出592份EV陽性標(biāo)本：269份CVA16、93份EV71和230份EV-U；230份EV-U陽性標(biāo)本中確定分型167份：117份CVA6、29份CVA10、16份CVA4、2份CVA12、1份CVA5、1份CVA21和1份CVB4。

2.2非EV71非CVAl 6型EV的時間分布 10月以CVA6為第一優(yōu)勢流行株；4、9、11和12月CVA6超過EV71成為第二優(yōu)勢流行株；1、2月CVA6與EV71并列成為第二優(yōu)勢流行株；CVA6和CVA10分別在11月和6月檢出最多。

2.3CVA10的VP1基因序列的聚類分析 本研究對得到的29條CVA10完整VP1區(qū)，本地區(qū)CVA10的VP1基因核苷酸序列一致性為91.1%～100.0%(均值95.7%)；與CVA10原始株的一致性為76.0%～77.1%(均值76.6%)。根據(jù)核苷酸一致性將片段差異度大于15%分為不同基因型(圖1)：本地區(qū)CVA10為A型，聚為A.1-A.5簇，原始株Kowalik(Genbank序列號AY421767)單獨分為B型。本地區(qū)19株集中在A.1簇。比較基因簇間一致性，A.1與A.2一致性最高(94.4%%～96.5%，均值95.3%)，A.1與A.5一致性最低(91.1%～93.1%，均值92.6%)。時間分布顯示，A.1涵蓋了出現(xiàn)CVA10的六個月份：3、4、6-9。

依據(jù)地域及時間從NCBI下載國內(nèi)外CVA10完整VP1基因，包括國內(nèi)9個地方株，國外5株病毒和原始株，與2016年本地區(qū)CVA10的完整VP1基因進(jìn)行聚類分析。CVA16、EV71和CVA6的原始株VP1基因序列作為外群(圖1)。本研究將國內(nèi)外CVA10聚為5個基因型(A-E)：A型包括3株國外株(俄羅斯、西班牙、越南)和54株國內(nèi)株(包括29株本地區(qū)毒株)，B型由原始株構(gòu)成，C型包括2株山東株，D型有1株法國株，E型有1株馬達(dá)加斯加株。A型聚為A.1-A.9簇：A.1簇由本地區(qū)19株株、2株福建株和1株湖南株構(gòu)成，本地區(qū)毒株與湖南株核苷酸一致性最高；A.2簇由本地區(qū)2株毒株、2株廣東株、2株河南株、1株湖南株、1株云南株和1株俄羅斯株構(gòu)成，本地區(qū)毒株與云南株核苷酸一致性最高；A.3簇由本地區(qū)3株構(gòu)成；A.4簇由本地區(qū)3株和1株山東株構(gòu)成；A.5簇由本地區(qū)2株和1株越南株構(gòu)成；A.6簇、A.7簇、A.8簇分別由非本地區(qū)的國內(nèi)12、4、2株構(gòu)成；A.9簇由1株西班牙株構(gòu)成。國內(nèi)毒株集中在A和C基因型，核苷酸序列時間聚類分析顯示：C基因型、A.8簇、A.6簇和A.1簇—A.5簇，形成了一個較為完整的時間軸，即2009年以前、2009-2014年和2012-2016年。

注：構(gòu)建聚類分析圖的CVA10VP1序列的檢測年份、地點和NCBI序列號如圖所示。地區(qū)縮寫如下：AH-安徽、BJ-北京、FJ-福建、GD-廣東、GZ-貴州、HeB-河北、HeN-河南、HuN-湖南、JS-江蘇、SD-山東、YN-云南?！翊?016年北京市朝陽區(qū)CVA10毒株，○為國外毒株，組外對照為CVA16、EV71和CVA6的原始株。圖1 國內(nèi)外CVA10完整VP1聚類分析圖

3 討論

3.1北京市朝陽區(qū)2013年首次出現(xiàn)EV-U超過CVA16和EV71[2]，此次結(jié)果顯示，EV-U比例稍低于CVA16高于EV71，CVA6的比例高于EV71，這與多個結(jié)果一致[3-6]。此次結(jié)果顯示CVA10為EV-U中僅次于CVA6的優(yōu)勢型別，與該地區(qū)2013年的研究一致[2]，而國內(nèi)部分地區(qū)及本地區(qū)2012年的研究顯示CVA10為EV-U的首位[7-10]，青島2008年EV-U的優(yōu)勢型別為CVA12[11]。提示國內(nèi)EV-U的優(yōu)勢型別有時間和地域上的區(qū)別。人群感染HFMD相關(guān)病毒后只獲得長期而牢固的型特異性免疫，因此,優(yōu)勢流行株改變可能引起新一輪HFMD暴發(fā)流行。EV71疫苗不具備對EV-U的交叉保護，本研究支持研發(fā)以EV71、CVA16及CVA6和CVA10為主要成分的聯(lián)合疫苗[12]。CVA6有6個月成為第二優(yōu)勢流行株，建議將CVA6納入日常監(jiān)測。

3.2通過CVA10的VP1基因聚類分析可以發(fā)現(xiàn)：①CVA10在本地區(qū)同時存在A.1-A.5基因簇的共循環(huán)，A.1簇涵蓋了CVA10的整個流行期，對本地區(qū)CVA10的流行起關(guān)鍵作用；相比于2009年北京市西城區(qū)的分析結(jié)果[13]，朝陽區(qū)的CVA10型別更為豐富；②CVA10在國內(nèi)同時存在A和C兩種基因型，A型為絕對優(yōu)勢型別，這與LU等[14]研究結(jié)果一致；③朝陽區(qū)的CVA10在2009-2016年發(fā)生了基因簇轉(zhuǎn)換：A.6簇逐漸消失，A.1簇成為主要流行株，這種基因位點變異引起的病毒型別轉(zhuǎn)換有可能引起毒力及親和力的變化，導(dǎo)致高致病性或高傳播力的新型病毒出現(xiàn)。

3.3朝陽區(qū)2016年EV-U至少包括CVA6、CVA10、CVA4、CVA12、CVA5、CVA21、CVB4。當(dāng)多種EV在同一地區(qū)共同流行，核酸變異和重組會導(dǎo)致新型病毒出現(xiàn)，進(jìn)而引發(fā)新發(fā)傳染病流行[15]。加強對HFMD病毒譜日常監(jiān)測，掌握其生物學(xué)特性及流行特征，可為HFMD預(yù)警、監(jiān)控和防治工作提供依據(jù)。