張 丹，付永利，唐佩娟，劉 鑫，殷 茵，于海霞，李澤清，張 穎，李 奎，崔茂盛*

（1.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402；2.天津市畜牧總站，天津 300402；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100094）

自從20世紀(jì)80年代豬人工授精廣泛應(yīng)用以來，現(xiàn)階段實(shí)際輸精操作中90%以上采用恒溫保存精液，有研究表明，精液稀釋倍數(shù)對精液的長期保存具有明顯的影響，稀釋比例較小，精子密度較大，隨著精子不斷代謝導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)無法滿足精子的長期存活；除此以外，高密度精子代謝產(chǎn)生的不利影響較大。而精液稀釋比例過大，精子易受稀釋打擊，導(dǎo)致有效精子數(shù)降低，進(jìn)一步影響人工授精質(zhì)量[1-2]。因此生產(chǎn)中普遍采用4～6倍稀釋[3]。本試驗(yàn)是在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討本課題組自行研發(fā)的豬鮮精17 ℃常溫保存稀釋劑在高倍稀釋下對精子的保護(hù)效果。期望在保證精液保存質(zhì)量的前提下，提高豬精液稀釋比例，增加優(yōu)秀種公豬精液利用率。

1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1 試驗(yàn)時(shí)間

2018年4月-2018年10月。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

天津市天泰星火豬人工授精服務(wù)中心。

1.3 試驗(yàn)材料與方法

1.3.1 精液采集

試驗(yàn)選取5頭進(jìn)行正常生產(chǎn)的2～4歲大白種公豬，采用手握法采精，收集中段富含精子部分，精子活率達(dá)到0.8以上、精子密度在1.5億/mL以上的原精用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 試劑與儀器

主要試劑：果糖、海藻酸鈉（上海源葉生物科技有限公司），葡萄糖（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），青霉素、鏈霉素（山東魯抗舍里樂藥品有限公司），甘氨酸、EDTA等（sigma中國有限公司）。

主要儀器設(shè)備：CASA計(jì)算機(jī)自動(dòng)輔助分析系統(tǒng)（福州鴻視野軟件技術(shù)有限公司），相差顯微鏡（蔡司ZEISS），恒溫冰箱（青島畜牧有限公司），電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），精子快速染液（南京建成生物科技有限公司）。

1.3.3 稀釋液配制

BTS：使用分析天平稱取 EDTA 1.25 g，碳酸鈉1.25 g，檸檬酸鈉14.8 g，氯化鉀0.75 g，青霉素0.6 g，葡萄糖37 g，硫酸鏈霉素1 g，使用磁力攪拌器充分溶解于900 mL的滅菌蒸餾水中，調(diào)pH至7.2，定容至1 L。

配方組：在BTS稀釋液基礎(chǔ)中每升添加海藻酸鈉1 g，果糖0.2 g和甘氨酸0.4 g。

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在17 ℃恒溫條件下，以BTS稀釋劑為對照、本課題研發(fā)的配方組為試驗(yàn)組，對原精進(jìn)行1，3，5，10和15倍稀釋，以精液有效保存時(shí)間、精子活力、質(zhì)膜和頂體完整性為保存效果的評價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.1 精子質(zhì)量檢測方法

精子活力為：直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)占精子總數(shù)的比值，此數(shù)值通過精子自動(dòng)分析儀自動(dòng)檢測；質(zhì)膜完整性采用低滲腫脹試驗(yàn)檢測；頂體完整率采用精子快速染液檢測。

2.2 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得的各組數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行前期處理，再用SPSS17.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA方差分析，并進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P值大于0.05表示差異不顯著，反之則差異顯著。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同稀釋比例下豬精液有效保存時(shí)間研究

本研究中精子活力是指：直線向前運(yùn)動(dòng)精子數(shù)占總精子數(shù)的百分率。有效保存時(shí)間是指精液稀釋后精子活力維持在60%以上的時(shí)間。不同稀釋比例豬精液有效保存時(shí)間如表1所示。

如表1所示，配方組在各稀釋比例下精子有效保存時(shí)間均顯著高于對照組（P＜0.05）。其中，配方組在5倍和10倍稀釋時(shí)精液有效保存時(shí)間分別為8.77 d和8.43 d，而15倍稀釋時(shí)配方組中精液有效保存時(shí)間明顯下降，僅為4.56 d。對照組中，精液最長有效保存時(shí)間為3倍稀釋下的3.1 d。

3.2 不同稀釋比例對精子質(zhì)膜完整性影響的研究

因?yàn)閷φ战M精液有效保存時(shí)間最長為3 d，因此本試驗(yàn)檢測第3天各稀釋比例的豬精子質(zhì)膜完整性，研究結(jié)果如表2所示。

保存第3天時(shí)，隨著原精稀釋比例的升高，對照組與配方組精子質(zhì)膜完整率均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，但配方組質(zhì)膜完整性均顯著高于對照組（P＜0.05）。5倍稀釋時(shí)，對照組質(zhì)膜完整率為70%，而配方組質(zhì)膜完整率為79%；10倍稀釋時(shí)，配方組精子質(zhì)膜完整率為82%，對照組則為69%；但15倍稀釋時(shí)，對照組和試驗(yàn)組質(zhì)膜完整性均有所下降。

3.3 不同稀釋比例對精子頂體完整性影響的研究

同樣，本試驗(yàn)檢測第3天各稀釋比例的豬精子頂體完整性，研究結(jié)果如表3所示。

保存第3天時(shí)，隨著原精稀釋比例的升高，BTS組與配方組精子頂體完整率均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，但配方組質(zhì)膜完整性均顯著高于對照組（P＜0.05）。5倍稀釋時(shí)，對照組質(zhì)膜完整率為76%，而配方組質(zhì)膜完整率為85%；10倍稀釋時(shí)，配方組精子質(zhì)膜完整率為87%，對照組則為73%；但15倍稀釋時(shí)，對照組和試驗(yàn)組頂體完整性均有所下降。

4 討論

本科研團(tuán)隊(duì)已研發(fā)出豬精液高效稀釋劑，在17 ℃常溫保存可穩(wěn)定5～7 d，若原精質(zhì)量較好可有效保存10 d以上[4]；在此基礎(chǔ)上本課題還研發(fā)了豬精液4 ℃低溫保存高效稀釋液，進(jìn)一步延長了豬精液體外保存時(shí)間[5]。本試驗(yàn)旨在探討本課題研發(fā)的豬精液17 ℃常溫保存稀釋液在對豬精原精進(jìn)行高倍稀釋條件下，對精子的保存效果。精液稀釋倍數(shù)一般要結(jié)合精液自身的品質(zhì)進(jìn)行確定，生產(chǎn)中常利用精子密度、活率判斷稀釋倍數(shù)[6-8]。張金玲等人利用不同稀釋比例探究抗生素種類對精液保存質(zhì)量的影響，結(jié)果表明，常溫保存的最佳稀釋比例為1∶1～1∶2[9]，但沈培敏等人對豬精液稀釋倍數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，稀釋倍數(shù)為4倍和6倍時(shí)精子的活率較高，并且具有較高的受胎率[10]。不同研究結(jié)果的出現(xiàn)可能和稀釋液的成分組成相關(guān)[11]，本試驗(yàn)采用果糖+甘氨酸+海藻酸鈉的組合形式，結(jié)果表明：隨著原精稀釋比例的增加，對照組與配方組精子活力、質(zhì)膜完整率及頂體完整率均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。但配方組對原精采用10倍稀釋，保存第3天時(shí)，精子活力仍達(dá)到60%，質(zhì)膜完整率為82%，頂體完整率為87%，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。表明配方組的海藻酸鈉、果糖和甘氨酸有效成分，不僅可以滿足高倍稀釋精子的營養(yǎng)需要，而且能夠較好地降低精液高倍稀釋過程所受稀釋打擊，對精子具有一定保護(hù)作用。這可能與海藻酸鈉常溫條件下能夠形成凝膠從而避免蛋白、細(xì)胞和酶等活性物質(zhì)的失活的理化性質(zhì)相關(guān)；羅光彬等人研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸對冷凍保存精子活力具有較好的維持作用[12]，表明甘氨酸對精子的體外保存也具有一定積極影響，另外，果糖作為精漿的有效組成成分之一，不僅能夠直接被精子利用，而且對于精子活力的維持、頂體保護(hù)也具有一定作用。這與深林松等人認(rèn)為果糖對精子運(yùn)動(dòng)性能有利的試驗(yàn)結(jié)果相一致[13]。綜上，本課題組研發(fā)的豬精液稀釋劑可以對豬原精進(jìn)行10倍左右的稀釋，大大提高了優(yōu)秀種公豬精液利用率。

表1 不同稀釋倍數(shù)精子有效保存時(shí)間

表2 不同稀釋倍數(shù)對豬精子質(zhì)膜完整性的影響

表3 兩種稀釋劑在不同稀釋倍數(shù)時(shí)對精子頂體完整性的影響