陳婷婷 任秋楠 陳嫻嫻 曹新芳 黃卉卉 張盛周

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蕪湖 241000)

血細(xì)胞是動(dòng)物血液的重要組成部分, 脊椎動(dòng)物血細(xì)胞可分為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血栓細(xì)胞三類, 分別在機(jī)體內(nèi)的氣體運(yùn)輸、免疫防御和凝血中發(fā)揮重要作用[1—3]。血細(xì)胞對(duì)動(dòng)物自身生理狀態(tài)變化和外界環(huán)境因子刺激十分敏感, 其形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目與動(dòng)物的生理機(jī)能和健康狀況密切相關(guān), 相關(guān)參數(shù)對(duì)于動(dòng)物的健康監(jiān)測(cè)和疾病診斷有重要意義[2,3]。

目前對(duì)哺乳動(dòng)物特別是人類血細(xì)胞的種類、結(jié)構(gòu)和功能已有較全面而深入的認(rèn)識(shí)。隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展, 對(duì)魚類外周血細(xì)胞的研究也已廣泛開展, 有學(xué)者對(duì)鱖(Siniperca chuatsi)[4]、海鰻(Muraenesox cinereus)[5]、中華鱘(Acipenser sinensis)[6]等魚類外周血細(xì)胞的顯微及亞顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察, 亦有學(xué)者對(duì)齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)[1]、花斑裸鯉(Gymnocypris eckloni)[7]、鋸蓋魚(Centropomus parallelus)[8]、玉麗體魚(Cichlasoma dimerus)[9]等魚類外周血細(xì)胞的細(xì)胞化學(xué)特征和功能進(jìn)行了研究探討, 這些研究表明不同魚類外周血細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能既有一定的共性, 也有明顯的物種特異性。

團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)隸屬硬骨魚綱鯉形目鯉科魴屬, 又稱武昌魚, 主要分布于長江中下游的附屬湖泊中, 為我國特有魚種。因其肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)價(jià)值高且易飼養(yǎng), 自1990年起, 該魚被引種到全國各地, 成為我國主要淡水養(yǎng)殖魚類之一。隨著團(tuán)頭魴養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)大, 對(duì)其基礎(chǔ)生物學(xué)研究也在不斷深入開展。在血細(xì)胞方面, 吳維寧[10]對(duì)團(tuán)頭魴腎臟、肝臟、脾臟及小腸等造血器官中血細(xì)胞的發(fā)育過程進(jìn)行了研究; 鄒曙明等[11]對(duì)多倍體團(tuán)頭魴紅細(xì)胞的形態(tài)、體積及數(shù)量進(jìn)行了研究,并探討了紅細(xì)胞的表觀遺傳特征。但團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞化學(xué)組分尚未見報(bào)道。本文采用常規(guī)瑞氏和7種細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì)團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)與細(xì)胞化學(xué)特征進(jìn)行了研究, 旨在增進(jìn)對(duì)團(tuán)頭魴血細(xì)胞的類型、結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí), 為團(tuán)頭魴的健康檢測(cè)及病理診斷提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮活的團(tuán)頭魴購自蕪湖市黃山西路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),雌雄各4尾, 體重約500 g, 無明顯傷病。

1.2 血細(xì)胞涂片制備

用鈍器敲擊團(tuán)頭魴后腦, 將其敲暈后, 用注射針在尾靜脈取血并迅速注入有抗凝劑的采血管內(nèi)。取血結(jié)束后立刻涂片, 每條魚制作40張血涂片,室溫下自然晾干備用。一部分血涂片用于常規(guī)瑞氏染色, 觀察團(tuán)頭魴各種外周血細(xì)胞的顯微形態(tài);另一部分用于細(xì)胞化學(xué)染色, 研究團(tuán)頭魴各種外周血細(xì)胞的細(xì)胞化學(xué)特征。

1.3 常規(guī)瑞氏染色

將血涂片置于濕盒中, 滴加0.5 mL瑞氏A染液使其覆蓋整個(gè)血涂片, 室溫下染色約30s; 再滴加等量的瑞氏B緩沖液, 用吸耳球?qū)⑷芤捍祫? 靜置染色10min, 用蒸餾水緩慢沖掉染液, 室溫自然晾干, 鏡檢。

1.4 細(xì)胞化學(xué)染色

細(xì)胞化學(xué)染色方法參照文獻(xiàn)[12]中進(jìn)行, 略有改良。

過碘酸-雪夫(PAS)反應(yīng)顯示糖類血涂片經(jīng)95%的乙醇溶液固定10min后, 置于 10 mg/mL的高碘酸溶液氧化15—20min, 蒸餾水沖洗3次, 再用雪夫染液室溫染色45min; 亞硫酸溶液漂洗3—4次,再用蒸餾水緩慢沖洗干凈; 20 mg/mL的甲基綠溶液復(fù)染約15min, 蒸餾水沖洗, 室溫自然晾干, 鏡檢。

蘇丹黑B(SBB)染色法顯示脂類血涂片經(jīng)甲醛蒸汽固定后, 用蘇丹黑B染色液37℃染色40min; 然后先用70%的乙醇溶液沖洗3—4次, 再用蒸餾水繼續(xù)沖洗1min, 最后用瑞氏染色液復(fù)染30min, 蒸餾水沖洗, 室溫自然晾干, 鏡檢。

Gomori硫化鉛法顯示酸性磷酸酶(ACP)血涂片經(jīng)甲醛蒸汽固定后, 置于作用液(12 mL醋酸緩沖液pH 7.4, 50 mg/mL硝酸鉛2 mL, 32 mg/mL β-甘油磷酸鈉4 mL)中, 37℃反應(yīng)4h后用蒸餾水洗凈;室溫待干后, 置于2%的硫化銨溶液中顯色1—2min,蒸餾水沖洗干凈后, 20 mg/mL的甲基綠染液復(fù)染15min, 蒸餾水沖洗, 室溫自然晾干, 鏡檢。

卡氏偶氮偶聯(lián)法顯示堿性磷酸酶(AKP)血涂片經(jīng)10%的甲醛甲醇溶液固定30s后, 置于作用液(α-磷酸萘酚鈉20 mg, 0.05 mol/L丙二醇緩沖液20 mL, 固醬紫GBC鹽20 mg)中, 室溫反應(yīng)15—20min,蒸餾水洗凈; 蘇木素染液復(fù)染5—8min, 蒸餾水洗凈, 室溫自然晾干, 鏡檢。

四甲基聯(lián)苯胺法顯示過氧化物酶(POX)將2 mL 0.1%的四甲基聯(lián)苯胺乙醇溶液和20 μL亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液混勻后, 滴加在血涂片上,室溫反應(yīng)1min, 再滴加0.7 mL稀H2O2溶液, 用洗耳球吹勻后, 繼續(xù)染色6min; 然后用蒸餾水沖洗3—4次, 瑞氏染液復(fù)染15—20min, 蒸餾水洗凈, 室溫自然晾干, 鏡檢。

氯乙酸萘酚(AS-DCE)染色法顯示特異性酯酶血涂片經(jīng)1 0%的甲醛甲醇溶液固定30s—1min后, 置于作用液(10 mg氯乙酸AS-D萘酚,0.5 mL丙酮, 5 mL磷酸緩沖液pH 7.4, 10 mg固醬紫GBC鹽)中37℃反應(yīng)30min, 然后用蒸餾水將染液沖去, 蘇木素染液復(fù)染5min, 蒸餾水洗凈, 室溫自然晾干, 鏡檢。

酸性α-醋酸萘酚(ANAE)染色法顯示非特異性酯酶血涂片經(jīng)0.68%的甲醛生理鹽水固定5min后, 用蒸餾水緩慢沖洗3—5次, 然后將作用液(0.067 mol/L磷酸緩沖液10 mL、10 mg/mL α-醋酸萘酚0.2 mL、10 mg固醬紫GBC鹽)滴加在血涂片上37℃反應(yīng)1h, 用蒸餾水沖洗3—4次, 10 mg/mL的甲基綠染液復(fù)染5—15min, 蒸餾水洗凈, 室溫自然晾干, 鏡檢。

1.5 染色結(jié)果評(píng)價(jià)

根據(jù)Tavares-Dias[13]的評(píng)價(jià)方法, 將陽性區(qū)域超過細(xì)胞質(zhì)面積 3/4 以上的記為強(qiáng)陽性(+++); 占1/2 為陽性(++); 面積不足1/2的為弱陽性(+)。沒有陽性反應(yīng)則記為陰性(—)。其中, 陽性反應(yīng)強(qiáng)度與細(xì)胞染色深淺呈正比。

1.6 測(cè)量和數(shù)據(jù)處理

用Olympus BX61 型顯微鏡在100倍視野下對(duì)血細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行觀察拍照和計(jì)數(shù),雌雄個(gè)體各4尾, 每條計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞, 統(tǒng)計(jì)出各種白細(xì)胞和血栓細(xì)胞的平均百分比; 用測(cè)微尺對(duì)細(xì)胞大小進(jìn)行測(cè)量, 各雌雄個(gè)體每種細(xì)胞各測(cè)量20個(gè);使用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA), 求出平均值并比較數(shù)據(jù)間的差異顯著性,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極其顯著。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)

在光鏡下, 在團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞中可區(qū)分出紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血栓細(xì)胞。白細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。

紅細(xì)胞紅細(xì)胞約占血細(xì)胞總數(shù)的93.3%。成熟紅細(xì)胞一般呈橢圓形, 表面光滑, 細(xì)胞核通常為橢圓形或圓形, 位于細(xì)胞中央, 其染色質(zhì)較為致密, 經(jīng)瑞氏染色后細(xì)胞核呈紫紅色, 而細(xì)胞質(zhì)為均勻的灰色或淺黃色。此外, 偶爾可見體積較小、核質(zhì)疏松的幼稚紅細(xì)胞(圖 1A)和由紅細(xì)胞分解形成的淺粉色斑點(diǎn), 即為“核影”(圖 1B)。在團(tuán)頭魴的雄性個(gè)體中, 紅細(xì)胞胞體體積和胞核體積均比雌性紅細(xì)胞小, 其中胞核體積在雌雄性之間差異顯著(P＜0.05), 而胞體體積差異極其顯著(P＜0.01, 表 1)。

淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞為白細(xì)胞中數(shù)量最多的細(xì)胞, 一般為圓形或近圓形, 表面較為光滑。細(xì)胞核染色呈深紫色, 常偏于細(xì)胞一側(cè)或位于細(xì)胞中央, 核質(zhì)比較大, 在細(xì)胞核周圍只能看到薄薄的一層淺藍(lán)色胞質(zhì)(圖 1C)。

單核細(xì)胞單核細(xì)胞體積較大, 細(xì)胞長徑約11.0—14.5 μm, 通常為圓形或梨形, 少數(shù)為不規(guī)則形狀, 細(xì)胞表面不平整, 細(xì)胞核呈圓形或橢圓形, 占細(xì)胞體積的1/3至1/2。核內(nèi)染色質(zhì)較為疏松, 呈網(wǎng)狀, 染色較淺, 一般為淺紫色, 而細(xì)胞質(zhì)為淺藍(lán)色,其中可見空泡狀結(jié)構(gòu)(圖 1D)。

嗜中性粒細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞呈圓形或近圓形, 細(xì)胞核較小, 常偏于細(xì)胞一側(cè), 形狀不規(guī)則,有腎形、圓形、橢圓形及分葉形。由于其染色質(zhì)較為致密, 細(xì)胞核呈深紫色, 細(xì)胞質(zhì)則為淡藍(lán)色, 核質(zhì)界限清晰(圖 1E)。

嗜酸性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞為白細(xì)胞中數(shù)量最少的細(xì)胞, 胞體為圓形, 細(xì)胞核為橢圓形或腎形, 偏于細(xì)胞一側(cè)。細(xì)胞質(zhì)中可觀察到大量紫紅色、粗大的顆粒, 有時(shí)會(huì)覆蓋在細(xì)胞核之上(圖 1F)。

血栓細(xì)胞血栓細(xì)胞體積較小, 細(xì)胞長徑約4.5—6.5 μm, 細(xì)胞形態(tài)多樣, 主要有梭形、淚滴形、橢圓形及長桿形等四種形態(tài)。核質(zhì)比很大, 染色質(zhì)致密, 染色后顯紫色, 細(xì)胞質(zhì)極少, 近于無色(圖 1G)。?？梢姸鄠€(gè)血栓細(xì)胞聚集在一起(圖 1H)

2.2 白細(xì)胞和血栓細(xì)胞的大小和比例

在白細(xì)胞和血栓細(xì)胞中, 單核細(xì)胞體積最大、其次為嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞, 淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞顯著較小(表 1)。雄性個(gè)體淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞體積顯著小于雌性(P＜0.01); 雄性個(gè)體單核細(xì)胞體積略小于雌性, 且雄性個(gè)體細(xì)胞短徑顯著小于雌性(P＜0.05); 雌雄個(gè)體中嗜酸性粒細(xì)胞體積無顯著性差異(P＞0.05); 血栓細(xì)胞為團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞中體積最小的細(xì)胞, 在細(xì)胞長徑上顯現(xiàn)出了性別之間的差異, 雄性個(gè)體中細(xì)胞長徑顯著小于雌性(P＜0.05)。

圖 1 團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)Fig. 1 The microscopic structure of peripheral blood cells in Megalobrama amblycephalaA. 幼稚紅細(xì)胞 (IE); B. 核影紅細(xì)胞 (NSE), 成熟紅細(xì)胞 (ME); C. 淋巴細(xì)胞 (L); D. 單核細(xì)胞 (MO); E. 嗜中性粒細(xì)胞 (NE); F. 嗜酸性粒細(xì)胞 (EO); G. 單個(gè)血栓細(xì)胞 (THR); H. 聚集血栓細(xì)胞 (THR); 標(biāo)尺: 5 μmA. immature erythrocyte (IE); B. nuclear shadow erythrocyte (NSE), mature erythrocyte (ME); C. lymphocyte (L); D. monocyte (MO); E.neutrophil (NE); F. eosinophil (EO); G. single thrombocyte (THR); H. aggregate thrombocytes (THR); Scale bar = 5 μm

在白細(xì)胞和血栓細(xì)胞中, 淋巴細(xì)胞數(shù)量最多,在雌雄性中所占比例分別約為58.8%和59.9%; 血栓細(xì)胞其次, 在雌雄性中分別約占28%和22%; 單核細(xì)胞在雌雄性中所占比例分別約為10.3%和10.7%; 嗜中性粒細(xì)胞顯著較少, 在雌雄性中所占比例分別約為2.7%和6.2%; 嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量最少, 在雌雄性中都僅約占0.2%。雄性個(gè)體嗜中性粒細(xì)胞顯著多于雌性(P＜0.05), 其他白細(xì)胞和血栓細(xì)胞的比例在雌雄性之間均無顯著差異(P＞0.05, 圖 2)。

表 1 團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)Tab. 1 The morphological parameters of peripheral blood cells in Megalobrama amblycephala (Mean±SD, μm)

圖 2 團(tuán)頭魴分類白細(xì)胞及血栓細(xì)胞的比例Fig. 2 The proportion of classified leucocytes and thrombocyte in Megalobrama amblycephala不同字母(a, b, c, d, e)表示雄性團(tuán)頭魴不同種類細(xì)胞類型之間差異顯著 (P＜0.05); * 表示雌雄之間差異顯著(P＜0.05)Different letters (a, b, c, d, e) indicate the significant difference among different types of blood cells in Megalobrama amblycephala(P＜0.05); * indicates that the difference between male and female is significant (P ＜0.05)

2.3 白細(xì)胞和血栓細(xì)胞的細(xì)胞化學(xué)特征

過碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS)所有白細(xì)胞和血栓細(xì)胞胞質(zhì)均呈紅色(圖 3a1—a5), 其中, 單核細(xì)胞胞質(zhì)中紅色顆粒稍多, 反應(yīng)為陽性(圖 3a2), 其他細(xì)胞紅色較淺, 均為弱陽性(圖 3a1、a3—a5)。

蘇丹黑B(SBB)單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞反應(yīng)均為陽性, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布著棕色的細(xì)小顆粒(圖 3b2—b4)。而淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞胞質(zhì)接近于無色, 且不含染色顆粒, 反應(yīng)為陰性(圖 3b1、b5)。

酸性磷酸酶(ACP)單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞反應(yīng)呈強(qiáng)陽性(圖 3c2、c3), 細(xì)胞質(zhì)中含有大量的棕黑色顆粒, 呈彌散狀分布; 嗜酸性粒細(xì)胞為陽性反應(yīng), 胞質(zhì)中顆粒數(shù)量較少, 顏色較淺(圖 3c4);而淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞沒有棕色顆粒存在, 為陰性反應(yīng)(圖 3c1、c5)。

堿性磷酸酶(AKP)所有白細(xì)胞和血栓細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均無染色顆粒, 均為陰性反應(yīng)(圖 3d1—d5)。

過氧化物酶(POX)單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞反應(yīng)均為強(qiáng)陽性, 細(xì)胞內(nèi)含有大量的紫黑色顆粒, 幾乎覆蓋整個(gè)胞質(zhì)(圖 3e2—e4)。而淋巴和血栓細(xì)胞胞質(zhì)中不含有染色顆粒, 為陰性反應(yīng)(圖 3e1、e5)。

圖 3 團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞的細(xì)胞化學(xué)染色Fig. 3 The cytochemical staining of peripheral blood cells in Megalobrama amblycephalaa1—a5. 過碘酸-雪夫染色: a1. 淋巴細(xì)胞; a2. 單核細(xì)胞; a3. 嗜中性粒細(xì)胞; a4.嗜酸性粒細(xì)胞; a5. 血栓細(xì)胞; b1—b5. 蘇丹黑B染色: b1.淋巴細(xì)胞; b2. 單核細(xì)胞; b3. 嗜中性粒細(xì)胞; b4. 嗜酸性粒細(xì)胞; b5. 血栓細(xì)胞; c1—c5. 酸性磷酸酶染色: c1. 淋巴細(xì)胞; c2. 單核細(xì)胞;c3. 嗜中性粒細(xì)胞; c4. 嗜酸性粒細(xì)胞; c5.血栓細(xì)胞; d1—d5. 堿性磷酸酶染色: d1. 淋巴細(xì)胞; d2. 單核細(xì)胞; d3. 嗜中性粒細(xì)胞; d4. 嗜酸性粒細(xì)胞; d5. 血栓細(xì)胞; e1—e5. 過氧化物酶反應(yīng): e1. 淋巴細(xì)胞; e2. 單核細(xì)胞; e3. 嗜中性粒細(xì)胞; e4. 嗜酸性粒細(xì)胞; e5. 血栓細(xì)胞;f1—f5. 氯乙酸萘酚染色: f1. 淋巴細(xì)胞; f2. 單核細(xì)胞; f3. 嗜中性粒細(xì)胞; f4. 嗜酸性粒細(xì)胞; f5. 血栓細(xì)胞; g1—g5. 酸性-α-醋酸萘酯酶染色: g1. 淋巴細(xì)胞; g2. 單核細(xì)胞; g3. 嗜中性粒細(xì)胞; g4. 嗜酸性粒細(xì)胞; g5. 血栓細(xì)胞; L. 淋巴細(xì)胞; MO. 單核細(xì)胞; NE. 嗜中性粒細(xì)胞; EO. 嗜酸性粒細(xì)胞; THR血栓細(xì)胞; 標(biāo)尺: 5 μma1—a5. Periodic acid Schiff staining: a1. lymphocyte; a2. monocyte; a3. neutrophil; a4. eosinophil; a5. thrombocyte; b1—b5. Sudan black B staining: b1. lymphocyte; b2. monocyte; b3. neutrophil; b4. eosinophil; b5. thrombocyte; c1—c5. Acid phosphatase staining: c1.lymphocyte; c2. monocyte; c3. neutrophil; c4. eosinophil; c5. thrombocyte; d1—d5. Alkaline phosphatase staining: d1. lymphocyte; d2.monocyte; d3. neutrophil; d4. eosinophil; d5. thrombocyte; e1—e5. Peroxidase staining: e1. lymphocyte; e2. monocyte; e3. neutrophil; e4.eosinophil; e5. thrombocyte; f1—f5. Naphythol AS-D chloroacetate esterase staining: f1. lymphocyte; f2. monocyte; f3. neutrophil; f4.eosinophil; f5. thrombocyte; g1—g5.α-naphthol acetate esterase staining: g1. lymphocyte; g2. monocyte; g3. neutrophil; g4. eosinophil; g5.thrombocyte; L. lymphocyte; MO. monocyte; NE. neutrophil; EO. eosinophil; THR. thrombocyte; scale bar = 5 μm

氯乙酸AS-D萘酚酯酶(AS-DCE)單核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中可見較多均勻分布的紅色細(xì)小顆粒, 呈陽性反應(yīng)(圖 3f2), 其他白細(xì)胞及血栓細(xì)胞胞質(zhì)中染色較淺或染色不均, 為弱陽性反應(yīng)(圖 3f1、f3—f5)。

α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)所有白細(xì)胞及血栓細(xì)胞反應(yīng)均為陽性, 其中嗜酸性粒細(xì)胞陽性反應(yīng)較強(qiáng), 細(xì)胞質(zhì)中均勻分布著紫紅色顆粒, 為強(qiáng)陽性(圖 3g4); 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞呈陽性反應(yīng)(圖 3g1—g3); 血栓細(xì)胞反應(yīng)較弱, 細(xì)胞質(zhì)呈淺紫色, 且分布不均(圖 3g5)。

不同類型血細(xì)胞的細(xì)胞染色強(qiáng)度總結(jié)于表 2,淋巴細(xì)胞呈PAS及AS-DCE弱陽性, 呈ANAE陽性,其他染色均為陰性; 單核細(xì)胞POX和ACP染色為強(qiáng)陽性, PAS、SBB、AS-DCE和ANAE為陽性, 僅AKP染色為陰性; 嗜中性粒細(xì)胞呈ACP、POX強(qiáng)陽性, SBB和ANAE陽性, PAS和AS-DCE為弱陽性, 而AKP為陰性; 嗜酸性粒細(xì)胞為POX、ANAE強(qiáng)陽性,SBB、ACP陽性, PAS及AS-DCE為弱陽性, AKP為陰性; 血栓細(xì)胞呈PAS、AS-DCE及ANAE弱陽性,其他染色均為陰性。

表 2 團(tuán)頭魴白細(xì)胞的細(xì)胞化學(xué)特征Tab. 2 Cytochemical characteristics of peripheral blood cells in Megalobrama amblycephala

3 討論

3.1 團(tuán)頭魴外周血紅細(xì)胞的形態(tài)與大小

紅細(xì)胞的主要功能是通過血紅蛋白運(yùn)輸氧氣。有研究顯示, 在脊椎動(dòng)物中, 紅細(xì)胞的大小與物種的進(jìn)化地位有關(guān), 進(jìn)化地位越低等, 其紅細(xì)胞體積越大[14,15]。如兩棲類的紅細(xì)胞大于爬行類,而爬行類的紅細(xì)胞又大于哺乳類[14]。但本研究顯示團(tuán)頭魴紅細(xì)胞的體積要小于兩棲動(dòng)物[15]。在其他大多數(shù)魚類, 如斑馬魚(Danio rerio)[16]、稀有白甲魚(Onychostoma rarus)[17]、齊口裂腹魚[1]等的紅細(xì)胞體積也均小于兩棲動(dòng)物, 這與進(jìn)化規(guī)律存在矛盾。此現(xiàn)象可與魚類的生活環(huán)境與生活習(xí)性有關(guān), 研究表明, 紅細(xì)胞越小, 其攜氧能力越強(qiáng)[15], 魚類生活在水中且運(yùn)動(dòng)量相對(duì)較大, 而水中含氧量遠(yuǎn)低于陸上空氣中, 因此, 為維持體內(nèi)正常代謝,魚類對(duì)紅細(xì)胞攜帶氧氣能力有較高要求, 因而紅細(xì)胞體積較小。

團(tuán)頭魴紅細(xì)胞體積在雌雄性別之間存在明顯的差異, 雄性的紅細(xì)胞胞體體積和胞核體積都顯著小于雌性, 此現(xiàn)象在其他魚類中尚未見報(bào)道。紅細(xì)胞越小, 其攜氧能力越強(qiáng)[15], 可滿足機(jī)體較強(qiáng)的代謝活動(dòng)需求, 因而雄性團(tuán)頭魴紅細(xì)胞體積較小可能與其代謝活動(dòng)要強(qiáng)于雌性有關(guān)。

紅細(xì)胞的發(fā)育階段一般可分為幼稚期、未成熟期和成熟期。與哺乳動(dòng)物不同, 團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞中存在幼稚期的紅細(xì)胞, 亦可觀察到紅細(xì)胞的無絲分裂相, 這種現(xiàn)象在其他魚類如海鰻[5]和斑馬魚[16]中也有報(bào)道, 表明魚類紅細(xì)胞的除在造血器官中產(chǎn)生外, 還可通過外周紅細(xì)胞直接分裂產(chǎn)生。

3.2 團(tuán)頭魴外周血白細(xì)胞的種類和比例

本研究顯示, 團(tuán)頭魴白細(xì)胞可分為單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞, 未見嗜堿性粒細(xì)胞。袁仕取等[4]曾指出大部分硬骨魚類不含有嗜堿性粒細(xì)胞, 其僅在少數(shù)魚類外周血細(xì)胞中出現(xiàn)。如在海鰻[5]、中華鱘[6]及胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)[18]中都不曾發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞。對(duì)于此現(xiàn)象, 有學(xué)者認(rèn)為嗜堿性粒細(xì)胞為魚類血細(xì)胞中含量最少的顆粒細(xì)胞, 且主要存在于頭腎和脾臟中, 因此很難在外周血中發(fā)現(xiàn)[3]。亦有學(xué)者認(rèn)為, 嗜堿性顆粒在制片過程中極易解體, 所以難以在外周血中觀察到[19]。

關(guān)于淋巴細(xì)胞大、小之分, 一直以來都存在爭(zhēng)議, 有學(xué)者在研究中將大、小淋巴細(xì)胞當(dāng)作不同種類的細(xì)胞進(jìn)行分析, 如張艷珍等[6]對(duì)中華鱘的研究,曹文芝等[16]對(duì)斑馬魚的研究。但本研究發(fā)現(xiàn), 團(tuán)頭魴淋巴細(xì)胞體積大小的變化是連續(xù)性的, 沒有嚴(yán)格的大小之分, 因此, 沒有用“大淋巴細(xì)胞”和“小淋巴細(xì)胞”來定義體積不同的淋巴細(xì)胞。趙海鵬等[20]研究認(rèn)為, 體積不同的淋巴細(xì)胞可能只是不同發(fā)育階段的淋巴細(xì)胞, 而不是具有不同功能的不同種細(xì)胞。

在團(tuán)頭魴白細(xì)胞中, 淋巴細(xì)胞數(shù)量最多, 嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量最少, 這與白甲魚[17]、海鰻[5]、中華鱘[6]等多數(shù)魚類相同, 表明魚類白細(xì)胞的比例在不同物種間具有一定的共性; 單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞所占的比例則存在一定的物種特異性, 在團(tuán)頭魴中, 單核細(xì)胞數(shù)量多于嗜中性粒細(xì)胞, 這與斑馬魚[16]相同, 而與中華鱘[6]、齊口裂腹魚[1]不同。

3.3 團(tuán)頭魴血栓細(xì)胞的形態(tài)

和哺乳動(dòng)物的血小板相似, 魚類血栓細(xì)胞是具有凝血作用的細(xì)胞, 大量研究表明, 血栓細(xì)胞是魚類外周血細(xì)胞中數(shù)量較多的細(xì)胞, 如在海鰻[5]、胭脂魚[18]等魚中, 血栓細(xì)胞是除紅細(xì)胞外數(shù)量最多的細(xì)胞。本研究顯示, 在團(tuán)頭魴外周血中, 血栓細(xì)胞的數(shù)量?jī)H次于淋巴細(xì)胞, 且常聚集分布。本研究發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴血栓細(xì)胞形態(tài)多樣, 主要有梭形、淚滴形、橢圓形及長桿形等4種形態(tài)。有學(xué)者認(rèn)為血栓細(xì)胞的形態(tài)與取血時(shí)是否使用抗凝劑有關(guān), 使用抗凝劑往往只能觀察到較少的細(xì)胞形態(tài), 本研究取血時(shí)使用了抗凝劑, 但依然能觀察到多種形態(tài)的血栓細(xì)胞, 支持謝嘉華等[5]的觀點(diǎn), 即血栓細(xì)胞的不同形態(tài)與細(xì)胞的不同發(fā)育時(shí)期或功能狀況有關(guān)。

3.4 團(tuán)頭魴白細(xì)胞和血栓細(xì)胞的細(xì)胞化學(xué)特征

細(xì)胞化學(xué)染色是研究血細(xì)胞功能的重要方法,通過對(duì)血細(xì)胞內(nèi)特定物質(zhì)含量的檢測(cè), 可推斷其在機(jī)體內(nèi)行使的主要功能。

淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分, 參與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫。本研究顯示, 團(tuán)頭魴淋巴細(xì)胞呈PAS及AS-DCE弱陽性, 呈ANAE陽性, 呈SBB、ACP、AKP及POX陰性。與其他魚類相一致的是, 花斑裸鯉[7]、胭脂魚[18]等淋巴細(xì)胞都為PAS及ANAE陽性反應(yīng); 而與其他魚類不同的是,大部分魚類的淋巴細(xì)胞都具有ACP陽性反應(yīng), 如齊口裂腹魚[1]、鋸蓋魚[8]、墨瑞鱈(Maccullochella peelii peelii)[21]、長吻(Leiocassis longirostrisGünther)[22]等。PAS和SBB染色可分別顯示細(xì)胞內(nèi)糖原和脂類物質(zhì), 糖原與脂類物質(zhì)都可為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量[21]; 團(tuán)頭魴淋巴細(xì)胞呈PAS弱陽性表明細(xì)胞內(nèi)有一定的糖原積累, 可為細(xì)胞的代謝活動(dòng)提供能量, 而呈SBB陰性表明細(xì)胞內(nèi)不含脂質(zhì), 無法通過脂代謝來提供能量。ANAE是存在于溶酶體初級(jí)顆粒中的一種非特異性酯酶, 在細(xì)胞吞噬作用和抗原呈遞過程中發(fā)揮重要作用[1]。AS-DCE是一種特異性酯酶, 亦與吞噬作用有關(guān)[21]。ACP、AKP和POX則是參與細(xì)胞吞噬和殺菌作用的重要酶類[21]。團(tuán)頭魴淋巴細(xì)胞呈AS-DCE弱陽性, 呈ANAE陽性, 呈ACP、AKP和POX陰性, 表明淋巴細(xì)胞可能不具有吞噬作用及殺菌能力, 而可能會(huì)行使一定的抗原呈遞功能。

單核細(xì)胞具有吞噬殺菌能力, 在體內(nèi)非特異性免疫過程中扮演重要角色。在團(tuán)頭魴中, 單核細(xì)胞呈PAS、SBB、AS-DCE以及ANAE陽性, ACP、POX強(qiáng)陽性, 呈AKP陰性。在齊口裂腹魚[1]、花斑裸鯉[7]中, 單核細(xì)胞呈PAS、ACP、POX及ANAE陽性, 與團(tuán)頭魴的結(jié)果基本一致, 而在胭脂魚[18]及長吻[22]中只有PAS、ACP及ANAE呈陽性, SBB及POX呈陰性反應(yīng)。團(tuán)頭魴單核細(xì)胞呈PAS和SBB陽性表明胞內(nèi)具有較多的能源物質(zhì)積累, 可為細(xì)胞生命活動(dòng)提供充足能量; 呈ANAE陽性表明單核細(xì)胞具有抗原呈遞功能; 呈AS-DCE、ACP及POX陽性則表明該細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬殺菌能力。

嗜中性粒細(xì)胞在體內(nèi)主要與吞噬作用有關(guān), 團(tuán)頭魴嗜中性粒細(xì)胞呈PAS和AS-DCE弱陽性,SBB和ANAE陽性, POX和ACP強(qiáng)陽性, 呈AKP陰性。在長吻[22]中, 嗜中性粒細(xì)胞呈PAS、SBB、ACP、POX及ANAE陽性, 呈AKP陰性, 與團(tuán)頭魴的結(jié)果大體一致; 在花斑裸鯉[7]及齊口裂腹魚[1]中, 嗜中性粒細(xì)胞呈PAS、ACP、POX及ANAE陽性, 但呈SBB陰性, 這與團(tuán)頭魴的結(jié)果略有不同。團(tuán)頭魴嗜中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞染色結(jié)果相似, 表明嗜中性粒細(xì)胞在功能上和單核細(xì)胞類似, 參與體內(nèi)的抗原遞呈和吞噬殺菌等免疫防御過程。

嗜酸性粒細(xì)胞通常在與寄生蟲感染相關(guān)的免疫防御過程中起吞噬異物的作用。在團(tuán)頭魴中, 嗜酸性粒細(xì)胞呈PAS、AS-DCE弱陽性, SBB、ACP陽性, ANAE及POX強(qiáng)陽性, 呈AKP陰性。在花斑裸鯉[7]中, 嗜酸性粒細(xì)胞僅為PAS、ACP及ANAE陽性, 與團(tuán)頭魴染色結(jié)果差異較大, 嗜酸性粒細(xì)胞的化學(xué)特征在其他大部分魚類中都未見報(bào)道。團(tuán)頭魴嗜酸性粒細(xì)胞染色結(jié)果與單核細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞相似, 呈PAS、SBB陽性, 表明嗜酸性粒細(xì)胞含有豐富的能源物質(zhì); 呈ACP陽性、ANAE及POX強(qiáng)陽性, 表明嗜酸性粒細(xì)胞具有吞噬作用及較強(qiáng)的殺菌功能。

血栓細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)主要行使凝血的功能, 但在某些魚類中發(fā)現(xiàn)血栓細(xì)胞也具有吞噬作用[4]。團(tuán)頭魴血栓細(xì)胞呈PAS、AS-DCE及ANAE弱陽性, 呈SBB、ACP、AKP及POX陰性。與其他魚類相一致的是, 一些魚類如花斑裸鯉[7]、鋸蓋魚[8]和胭脂魚[18]等血栓細(xì)胞亦呈PAS和ANAE陽性; 而與其他魚類不同的是, 大部分魚類如鋸蓋魚[8]、胭脂魚[18]、齊口裂腹魚[1]和長吻[22]等血栓細(xì)胞呈ACP陽性。團(tuán)頭魴血栓細(xì)胞內(nèi)不含有ACP和POX, 表明血栓細(xì)胞不具有吞噬和殺菌能力, 呈ANAE陽性則表明其可能具有呈遞抗原的功能。

總之, 團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞的種類、顯微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞化學(xué)特征與其他魚類有相似之處, 也有其明顯的物種特異性, 如團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞大小存在顯著的性別差異; 團(tuán)頭魴外周血中未見嗜堿性粒細(xì)胞,存在多種形態(tài)的血栓細(xì)胞; 團(tuán)頭魴淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞呈ACP陰性, 而其他大多數(shù)魚類白細(xì)胞和血栓細(xì)胞均呈ACP陽性; 團(tuán)頭魴單核細(xì)胞和粒細(xì)胞呈SBB陽性, 而其他大多數(shù)魚類白細(xì)胞均為SBB陰性或只有中性粒細(xì)胞呈SBB陽性。本研究增進(jìn)了對(duì)團(tuán)頭魴外周血細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí), 為團(tuán)頭魴的健康監(jiān)測(cè)和病理診斷提供了基礎(chǔ)資料。值得說明的是, 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所用鮮活團(tuán)頭魴購自于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),可能處于應(yīng)激狀態(tài), 因而本研究結(jié)果是否與正常生活狀態(tài)相符有待進(jìn)一步確證。