呂歡，劉瑤，樊迎，王如福*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 晉中 030801)

壺瓶棗(ZiziphusjujubeMill. cv. Hupingzao)是鼠李科棗屬植物的果實，其個大、皮簿、肉厚、風味甘美，有“八個一尺，十個一斤”之美稱[1]。壺瓶棗富含黃酮類、有機酸、三萜類、環(huán)磷酸腺苷、維生素、微量元素等[2]。同時壺瓶棗含糖量也相當高，可以很好被酵母菌、醋酸菌等發(fā)酵微生物所利用。此外，壺瓶棗是一種滋補佳品，中醫(yī)認為其有補中益氣、養(yǎng)血安神、潤心肺、補五臟、治虛損及解毒等功效[3]。近年來，隨著壺瓶棗種植面積增加，其產(chǎn)量不斷提高，但壺瓶棗易裂口、不耐貯運，這嚴重制約了棗農(nóng)的經(jīng)濟收入，故對裂棗進行綜合開發(fā)和深加工較為迫切[4,5]。

棗醋營養(yǎng)豐富，兼有棗和食醋的多種營養(yǎng)保健功能。棗醋作為一種美味的保健品，能開胃消食、預防感冒、消除疲勞、醒酒、降低血脂含量、防治高血壓及動脈硬化，并對神經(jīng)衰弱具有輔助性治療作用[6]。目前，棗醋的發(fā)酵工藝已經(jīng)比較成熟，但運用優(yōu)勢菌株強化發(fā)酵過程的研究較少，因此棗醋仍有較大的開發(fā)潛力及廣闊的市場前景[7]。

本文的研究對象為山西省太谷縣的特色水果——壺瓶棗。將其進行液態(tài)發(fā)酵制醋，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計，通過響應面分析，對壺瓶棗醋酒化階段和醋化階段的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，以期為壺瓶棗的深加工提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

1.1.1 原料

裂口壺瓶棗：山西農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所。

1.1.2 菌種

巴氏醋酸菌A3-7：山西農(nóng)業(yè)大學山西老陳醋菌種庫。

1.1.3 試劑

酵母膏、葡萄糖、瓊脂、無水乙醇、碳酸鈣、氫氧化鈉等：常規(guī)分析純；安琪釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DS-1組織搗碎機 上海昂尼儀器儀表有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；ZQPL-200立體式全溫振蕩培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；GZX-9420電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；STARTER 3100 pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司；LS-35LJ立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；79-1型磁力加熱攪拌器 常州潤華電器有限公司；FA224電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；手持折光儀 北京中西遠大科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

果實挑選→清洗瀝干→去核→破碎打漿→過濾取汁→酶解→滅酶滅菌→調(diào)糖調(diào)酸→加入酵母→酒化發(fā)酵→接入醋酸菌→醋化發(fā)酵→過濾→裝瓶→殺菌→成品。

1.3.2 操作要點

原料挑選：裂口壺瓶棗(半紅期至全紅期)。

破碎、榨汁[8]：破碎、去核，將果肉放入搗碎機，按質(zhì)量比1∶4 加水進行打漿；然后過濾。

酶解、澄清[9]：將濾液升溫至50 ℃左右，并加入濾液0.1%的果膠酶，恒溫水解3 h；再升溫至85 ℃滅酶10 min，最后降至25 ℃。將滅酶后的酶解液離心(4000 r/min,10 min)，取上清液。

調(diào)糖調(diào)酸[10,11]：測出此時棗汁的可溶性固形物含量，以白砂糖調(diào)整后棗汁的可溶性固形物含量作為試驗設定值，并用檸檬酸調(diào)整pH值為3.5～4.0。

酒化階段：以調(diào)整好成分的壺瓶棗棗汁為原料，接入適量安琪酵母置于恒溫培養(yǎng)箱中進行酒化發(fā)酵，1～3 d敞口發(fā)酵，4～8 d封口發(fā)酵，隨后每天同一時間取樣，并測定酒精度。

醋化階段：以酒化后的發(fā)酵液為原料，接入適量巴氏醋酸菌放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在一定溫度條件下發(fā)酵10 d，并每天同一時間取樣，測定酸度。

1.3.3 酒化階段單因素試驗設計

以酒精度作為評價指標，固定基本條件為[12]：可溶性固形物含量(soluble solid content，SSC，下同)8%、酵母菌接種量(以壺瓶棗棗汁含量計算)0.4%、發(fā)酵溫度30 ℃。采用控制變量的單因素輪換法，分別考察并確定出SSC(5%、6%、7%、8%、9%)、酵母菌接種量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)、發(fā)酵溫度(24，26，28，30，32 ℃)這3個因素的合適水平。

1.3.4 醋化階段單因素試驗設計

以總酸含量作為評價指標，固定基本條件為：初始酒精度8.0%、醋酸菌接種量(以壺瓶棗棗汁含量計算)7%、發(fā)酵溫度34 ℃。同樣采用單因素輪換法，分別考察并確定出初始酒精度(7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%)、醋酸菌接種量(1%、3%、5%、7%、9%)、發(fā)酵溫度(32，34，36，38，40 ℃)這3個因素的合適水平。

1.3.5 響應面試驗設計

在單因素試驗數(shù)據(jù)基礎上，對酒化階段的SSC、酵母菌接種量、發(fā)酵溫度這3個因素的優(yōu)選水平和醋化階段的初始酒精度、醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度這3個因素的優(yōu)選水平分別進行Box-Behnken中心組合試驗。每組試驗各包括17個試驗點，其中12個析因點，5個零點重復以估計誤差。用Design-Expert 8.0軟件建立回歸模型，確定酒化和醋化階段的最優(yōu)工藝條件。兩個階段的因素水平編碼值見表1和表2。

表1 酒化階段響應面因素水平編碼表Table 1 The response surface factors and levels coding table in alcoholization stage

表2 醋化階段響應面因素水平編碼表Table 2 The response surface factors and levels coding table in acetification stage

1.3.6 指標測定方法

SSC含量：手持折光儀[13]；

酒精度(酒精計法)：根據(jù)GB/T 15038-2006操作；

總酸度：根據(jù)GB/T 5009.41-1996操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒化階段各單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 SSC對酒精度的影響

圖1 SSC對酒精度的影響Fig.1 Effect of soluble solid content on alcohol content

由圖1可知，酒化階段酒精度的整體變化趨勢一致：前1～3 d酒醪的酒精度增長較快，之后增長較平緩。但不同SSC所對應的最終酒精度不同：當SSC為5%時，由于還原糖含量低，可供酵母菌發(fā)酵的底物不足，導致最終酒精度也最低；當SSC為9%時，最終酒精度也明顯低于其他幾組，說明糖度過高抑制了微生物的正常代謝；當SSC為7%時，最終獲得的酒精度最高(8.2%)。說明SSC過高或過低都不利于酒化時酒精的生成，過高可能會導致糖類發(fā)酵不完全，過低則會抑制發(fā)酵。故選擇SSC 7%為最適水平，選擇6%、7%、8%這3個水平進行響應面優(yōu)化。

2.1.2 酵母菌接種量對酒精度的影響

圖2 酵母菌接種量對酒精度的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation amount on alcohol content

由圖2可知，酵母菌接種量在一定范圍內(nèi)，酒精發(fā)酵7 d后基本停止發(fā)酵。當酵母菌接種量為0.3%時，酒醪的最終酒度達到最高(8.0%)；接種量大于0.3%時，隨著接種量增加，菌種會消耗更多的糖分用于自身代謝，故最終酒精度越低；接種量為0.1%時，酒精度最低，未達到6.0%，原因是接種量太少，發(fā)酵能力不足致使發(fā)酵不完全。綜上所述，酵母菌最佳接種量為0.3%，選擇0.2%、0.3%、0.4%這3個酵母菌接種量水平進行響應面優(yōu)化。

2.1.3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響

圖3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content

適宜的發(fā)酵溫度不僅有利于菌株的生長繁殖，也利于代謝產(chǎn)物的積累。一般而言，隨著溫度的升高，酵母菌繁殖和代謝速度加快，產(chǎn)酒率也隨之升高；但當溫度過高時酵母菌會喪失活性而死亡，對發(fā)酵不利[14]。由圖3可知，敞口發(fā)酵前3 d(1～3 d)酒度增長速度較快，從封口發(fā)酵開始直到酒化結(jié)束，酒精度增長幅度不大，趨于平穩(wěn)狀態(tài)。當發(fā)酵溫度為28 ℃時，酒醪的最終酒精度達到最高8.0%；發(fā)酵溫度24 ℃時，因低溫抑制了酵母菌的生長繁殖，致使最終酒度低于7.0%；當發(fā)酵溫度為32 ℃時，最終酒精度也較低，表現(xiàn)出溫度過高對發(fā)酵過程的不利影響；當發(fā)酵溫度為26，30 ℃時，最終酒精度均接近于8.0%。因此，確定酒化階段最適溫度為28 ℃，選擇26，28，30 ℃這3個溫度水平進行響應面優(yōu)化。

2.2 酒化階段響應面試驗結(jié)果

在單因素基礎上，對SSC、酵母菌接種量、發(fā)酵溫度這3個因素進行響應面試驗，采用Design-Expert 8.0軟件提供的Box-Behnken試驗與響應面分析，以最終酒精度為響應值，優(yōu)化酒化階段的工藝參數(shù)，試驗設計及結(jié)果見表3。

表3 酒化階段響應面試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface test in alcoholization stage

續(xù) 表

運用Design-Expert 8.0對表3試驗結(jié)果進行回歸分析，獲得SSC(A)、酵母菌接種量(B)和發(fā)酵溫度(C)與酒精度(Y)的二次多項回歸方程式：

Y=9.04+0.21A-0.025B+0.088C-0.13AB+0.45AC+0.18BC-0.47A2-0.35B2-0.47C2。

對該響應面二次回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 響應面優(yōu)化酒化階段二階回歸模型方差分析Table 4 Response surface optimization of analysis of second-order regression model in alcoholization stage

注：若Prob>F值<0.05表明模型或因素影響顯著，用“*”表示；若Prob>F值<0.01表明影響極顯著，用“**”表示。

顯著性試驗結(jié)果以P值大小表示，P值<0.05，表明在統(tǒng)計學上有意義[15]，由表4可知，該回歸模型P=0.0008<0.01，表明該方程模型極顯著，具備統(tǒng)計學意義；失擬項不顯著(P=0.4459>0.05)，說明試驗誤差較小，所預測的結(jié)果較可靠。模型的決定系數(shù)R2=0.9520，調(diào)整決定系數(shù)R2(Adj)=0.8902和信噪比(C.V.，%)=2.03，說明預測值與試驗值相關性較好，即模型可信度高，故可以使用該模型確定酒化階段的最佳工藝。由表4中方差分析結(jié)果可知，本試驗建立的模型中一次項A、二次項A2、B2、C2及交互項AC影響極顯著(P<0.01)；交互項BC影響顯著(P<0.05)；一次項B和C及交互項AB影響不顯著(P>0.05)。

在ANOVA 結(jié)果的基礎上，運用Design-Expert 8.0繪制出各因素對酒精度影響的響應面圖，見圖4。

響應面可以直接反映各因素對酒精度的影響程度，響應面坡度越陡，說明該因素對酒精度影響越大；相反，響應面坡度越平緩，說明該因素對酒精度的影響越小[16]。3個因素之間的交互作用對酒精度的影響見圖4，其中，SSC與發(fā)酵溫度的交互作用、SSC與酵母菌接種量的交互作用對酒精度影響顯著，發(fā)酵溫度與酵母菌接種量的交互作用對酒精度影響不顯著。綜上所述，3個因素對酒精度的影響程度為：SSC(A)>發(fā)酵溫度(C)>酵母菌接種量(B)。

圖4 SSC、酵母菌接種量和發(fā)酵溫度對酒精度影響的響應面圖Fig.4 Response surface diagrams of soluble solid content, yeast inoculation amount and fermentation temperature on alcohol content

由Design-Expert 8.0分析處理得到酒化階段最佳發(fā)酵條件為：SSC 7.35%、發(fā)酵溫度28.51 ℃、酵母菌接種量0.30%，在此優(yōu)化條件下酒醪的酒精度理論值為9.08914%。為滿足工藝的實用性，將工藝參數(shù)改為: SSC含量7%、酵母菌接種量0.3%、發(fā)酵溫度28.5℃，并在此條件下，重復3次試驗進行驗證，得到酒醪酒精度的平均值為9.0%，與模型預測值吻合。

2.3 醋化階段各單因素試驗結(jié)果與分析

2.3.1 初始酒精度對總酸含量的影響

圖5 初始酒精度對總酸含量的影響Fig.5 Effect of initial alcohol content on total acid content

在醋化階段，酒精是醋酸菌作用的主要物質(zhì)，初始酒精度越高，則產(chǎn)酸量越高，但是酒精濃度過高時也會抑制醋酸菌的生長和代謝，反而使產(chǎn)酸量下降；當酒度太低時又不易產(chǎn)酸，這兩者情況均會影響產(chǎn)品的風味[17,18]，故有必要尋找最優(yōu)的初始酒精度。由圖5可知，8.0%的初始酒精度為臨界點，在該酒度下總酸含量最高，為4.1 g/dL；初始酒精度低于或高于8.0%，最終酸度值均低于4.1 g/dL，且初始酒精度跟8.0%相差越大，最終酸度值也愈低。綜上所述，初始酒精度8.0%為該因素的最適水平，選擇7.5%、8.0%、8.5%這3個水平進行響應面優(yōu)化。

2.3.2 醋酸菌接種量對總酸含量的影響

圖6 醋酸菌接種量對總酸含量的影響Fig.6 Effect of acetic acid inoculation amount on total acid content

醋酸菌作為醋化階段發(fā)酵的主要菌種，其接種量大小對最終產(chǎn)品酸度有直接影響[19]。由圖6可知，不同醋酸接種量下發(fā)酵前8 d均產(chǎn)酸迅速，總酸含量不斷增加；發(fā)酵最后2 d，總酸含量趨于平緩。當醋酸菌接種量為5%、7%、9%時，最終酸度值較低，可能由于接種量過大，菌體生長繁殖消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，導致產(chǎn)酸能力減弱；當接種量為1%時，由于菌種含量少，發(fā)酵不完全，最終導致總酸含量低于4 g/dL。整體來看，醋酸菌接種量過高或過低都不利于醋化發(fā)酵。當醋酸菌接種量為3%時，產(chǎn)酸能力最強，此時最終總酸含量為4.3 g/dL，與次優(yōu)值之間差距較大，為了更精確地優(yōu)化該因素，選擇2%、3%、4%這3個醋酸菌接種量水平進行響應面優(yōu)化。

2.3.3 發(fā)酵溫度對總酸含量的影響

圖7 發(fā)酵溫度對總酸含量的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on total acid content

由圖7可知，發(fā)酵溫度在36 ℃時，總酸含量達到最高；當溫度低于36 ℃時，酸度隨溫度的升高逐漸上升；當發(fā)酵溫度超過36 ℃時，酸度隨溫度的上升反而明顯下降。38 ℃與40 ℃條件下產(chǎn)醋酸量較少的主要原因可能是在高溫條件下，醋酸被氧化成二氧化碳和水[20]；而32 ℃與34 ℃時的最終酸度值不高的原因是低溫抑制了醋酸菌的活性，影響其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。所以認為36 ℃為醋化階段的最適發(fā)酵溫度，選擇34，36，38 ℃這3個水平進行響應面優(yōu)化。

2.4 醋化階段響應面試驗結(jié)果

在單因素基礎上，對初始酒精度、醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度這3個因素進行響應面試驗，設計因素及結(jié)果見表5。

表5 醋化階段響應面試驗設計及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface test in acetification stage

續(xù) 表

運用Design-Expert對所得的試驗結(jié)果進行回歸分析，獲得初始酒精度(A)、醋酸菌接種量(B)和發(fā)酵溫度(C)與總酸含量(Y)的二次多項回歸方程式：

Y=+4.80+0.43A+0.19B+0.19C-0.100AB+0.050AC+0.025BC-0.51A2-0.19B2-0.39C2。

對該響應面二次回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 響應面優(yōu)化醋化階段二階回歸模型方差分析Table 6 Response surface optimization of analysis of the second-order regression model in acetification stage

注：若Prob>F值<0.05表明模型或因素影響顯著,用“*”表示；若Prob>F值<0.01表明影響極顯著，用“**”表示。

由表6方差分析結(jié)果可知，本試驗建立的模型一次項A與二次項A2、C2影響極顯著(P<0.01)；一次項B和C與二次項B2影響顯著(P<0.05)；交互項 AB、AC、BC影響不顯著(P>0.05)。模型的決定系數(shù)R2=0.9754，調(diào)整決定系數(shù)R2(Adj)=0.9439和信噪比(C.V.，%)=3.77，說明預測值與試驗值有較好的相關性，可以使用該模型確定醋化階段的最佳工藝。

在ANOVA結(jié)果的基礎上，運用Design-Expert 8.0繪制出各因素對總酸含量影響的響應面圖，見圖8。

3個因素之間的交互作用對壺瓶棗醋總酸含量的影響見圖8。其中，初始酒精度與發(fā)酵溫度、初始酒精度與醋酸菌接種量的交互作用對總酸含量影響顯著，發(fā)酵溫度與酵母菌接種量的交互作用對總酸含量影響不顯著。由此可知，各因素對產(chǎn)品總酸含量影響程度為：初始酒精度(A)>發(fā)酵溫度(C)>醋酸菌接種量(B)。

圖8 初始酒精度、醋酸菌接種量和發(fā)酵溫度對總酸含量影響的響應面圖Fig.8 Response surface diagrams of initial alcohol content, acetic acid inoculation amount and fermentation temperature on total acid content

由Design-Expert分析處理得到醋化階段最佳發(fā)酵條件為：初始酒精度8.11%、醋酸菌接種量3.46%、發(fā)酵溫度36.54 ℃，在此優(yōu)化條件下所得產(chǎn)品總酸含量理論值為4.91426 g/dL。考慮工藝的實用性，將工藝參數(shù)改為：初始酒精度8%、醋酸菌接種量3.5%、發(fā)酵溫度36.5 ℃，并在此條件下，重復3次試驗進行驗證，得到壺瓶棗醋總酸含量的平均值為4.9 g/dL。預測值與真實值之間的誤差約為0.06 g/dL，表明響應面法對醋化發(fā)酵優(yōu)化的結(jié)果是合理有效的。

3 結(jié)論

本研究以裂口壺瓶棗為原料，釀造一種兼具壺瓶棗和醋營養(yǎng)價值的棗醋。通過單因素試驗、響應面法優(yōu)化出壺瓶棗醋酒化階段及醋化階段的最佳發(fā)酵工藝。得出酒化階段發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件為：SSC 7%、酵母菌接種量0.3%、發(fā)酵溫度28.5 ℃；醋化階段發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件為：初始酒精度8.0%、醋酸菌接種量3.5%、發(fā)酵溫度36.5 ℃。在此工藝條件下，棗醋總酸含量為4.9 g/dL，該研究不僅為壺瓶棗醋的生產(chǎn)釀造提供了技術(shù)參數(shù)，而且減少了裂果給棗農(nóng)帶來的經(jīng)濟損失。