石耀林,王丙云,畢利軍,陳 鑫,黃雯晶,陳 勇

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528225)

牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis)是由牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)引起的一種人獸共患慢性傳染病,我國將其列為二類動物疫病,接種疫苗是控制牛結(jié)核病的手段之一,目前為止卡介苗(BCG)是臨床上唯一應(yīng)用的抗牛結(jié)核病疫苗,但BCG的疫苗效果不均一性的問題引起研究者關(guān)注,因此尋找新型有效的疫苗尤為重要[1-3]。

現(xiàn)階段新型牛結(jié)核病疫苗較多研究重組BCG疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗和蛋白亞單位疫苗,而對分枝桿菌脂質(zhì)成分疫苗的研究尚不多,隨著耐多藥結(jié)核(MDR)及廣泛耐藥結(jié)核(XDR)的發(fā)現(xiàn),所以需要研發(fā)具有更安全有效的保護(hù)作用的新型牛結(jié)核疫苗應(yīng)用于臨床。結(jié)核菌是一種細(xì)胞壁富集脂類的細(xì)菌,其抗原性參與到結(jié)核免疫應(yīng)答,這里我們利用有機(jī)溶劑萃取結(jié)核菌細(xì)胞壁脂類[4],并通過薄層色譜法[5]探討B(tài)CG和恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁脂類成分差異,從而為研發(fā)新型牛結(jié)核疫苗提供新的方向,為分枝桿菌脂質(zhì)成分疫苗研究提供可能[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 BCG-pasteur菌株(實驗室保存);mc2155菌株(實驗室保存)。

1.1.2 儀器 薄層色譜展開缸(100 mm×200 mm),購自上海信誼儀器有限公司;層析板(100 mm×200 mm),購自青島海洋有限公司。

1.1.3 主要試劑 石油醚,氯仿,甲醇,丙酮,均為分析純試劑購,自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 Middbrook7H9液體培養(yǎng)基、Middbrook7H10固體培養(yǎng)基、增菌液OADC,均購自美國BD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種制備 將BCG-pasteur和mc2155菌株分別接種50 mL Middbrook7H9培養(yǎng)基,BCG-pasteur菌株培養(yǎng)1周,而 mc2155菌株培養(yǎng)到0.8～1.0OD后收集菌液,121℃滅活20 min,4 000 r/min離心10 min后棄上清,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)洗2次,收集菌體。

1.2.2 脂質(zhì)的萃取 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)烘干菌體,稱取100 mg干重的菌體[7]。先加入2 mL甲醇：0.3%NaCl(100∶10)溶液和1 mL石油醚到離心管,混勻20 min。3 500 r/min離心5 min后將上層液體移去新的離心管A,接著再加入1 mL石油醚再次混勻20 min萃取。再將上層液體移去離心管A,兩次上層液體合并,用氮氣干燥,析出非極性脂質(zhì)[8]。

1.2.3 二維薄層色譜法 左下角離板1 cm x 1 cm的距離涂點等量的脂質(zhì),標(biāo)記方向1與方向2,風(fēng)機(jī)下干燥樣品[9]。根據(jù)溶劑體系加入展開劑(如表1所示),按照方向1擺放底部,當(dāng)溶劑的前端滲透薄層板頂部,拿出風(fēng)干薄層板;加入新的展開劑換方向2[10],溶劑滲透頂部拿出風(fēng)干,用5%乙醇磷鉬酸染色,100℃燒灼薄層板15 min,掃描儀下掃描薄層。

1.2.4 圖片陰影相對值采用Imagej工具計算,脂質(zhì)陰影值用Mean表示。展開劑系統(tǒng)A-D見表1。

表1 2D-TLC分析脂質(zhì)的展開劑系統(tǒng)

2 結(jié)果與分析

2.1 2 D-TLC展開劑系統(tǒng)A分析比較 展開劑系統(tǒng)A下,可分離出三酰甘油和甲硫酚二角酰亞胺兩種脂質(zhì)成分,經(jīng)分析,BCG-pasteur中三酰甘油TAG的Mean值為72.724,甲硫酚二角酰亞胺PDIM的Mean值為55.991;mc2155中三酰甘油TAG的Mean值為50.176,甲硫酚二角酰亞胺PDIM的Mean值為49.594,含量均比BCG-pasteur的低。見圖1。

2.2 2 D-TLC展開劑系統(tǒng)B分析比較 展開劑系統(tǒng)B下,可分離出家族蛋白PAT、甘油二酯、游離脂肪酸和游離分枝菌酸,經(jīng)分析,BCG-pasteur中家族蛋白PAT的Mean值為36.79,甘油二酯DAG的Mean值為76.293;mc2155中家族蛋白PAT的Mean值為29.736,甘油二酯DAG的Mean值為25.142,含量均比BCG-pasteur的低。見圖2。

圖1 展開劑系統(tǒng)A下BCG-pasteur與mc2155菌株脂質(zhì)成分以及含量比較

圖2 展開劑系統(tǒng)B下BCG-pasteur與mc2155菌株脂質(zhì)成分以及含量比較

2.3 2 D-TLC展開劑系統(tǒng)C分析比較 展開劑系統(tǒng)C下,可更細(xì)分出游離脂肪酸與游離分枝菌酸,經(jīng)分析,BCG-pasteur中游離脂肪酸 FREE FATTY ACID的Mean值為86.676,游離分枝菌酸 FREE MYCOLIC ACID的Mean值為83.11;mc2155中游離脂肪酸FREE FATTY ACID的Mean值為15.445,游離分枝菌酸 FREE MYCOLIC ACID的Mean值為64.645,含量均比BCG-pasteur的低。展開劑系統(tǒng)C展開下的脂質(zhì)含量與系統(tǒng)B的相對應(yīng),因此該萃取方法以及展開劑系統(tǒng)具有重復(fù)性。見圖3。

圖3 展開劑系統(tǒng)C下BCG-pasteur與mc2155菌株脂質(zhì)成分以及含量比較

2.4 2 D-TLC展開劑系統(tǒng)D分析比較 展開劑系統(tǒng)D下,可分離出硫脂I類、硫脂III類和葡萄糖單霉菌酸酯,薄層色譜法結(jié)果顯示mc2155不含有硫脂I類。Imagej計算得出 BCG-pasteur中硫脂 III類SL-III的Mean值為19.281,海藻糖二霉菌酸酯TDM的Mean值為60.371;mc2155中硫脂III類SL-III的Mean值為5.118,海藻糖二霉菌酸酯TDM的Mean值為4.314,含量均比BCG-pasteur的低。見圖4。

圖4 展開劑系統(tǒng)D下BCG-pasteur與mc2155菌株脂質(zhì)成分以及含量比較

3 討論

本試驗主要是為了研究結(jié)核分枝桿菌的脂質(zhì)成分的不同,為新型牛結(jié)核疫苗和佐劑的研發(fā)提供基礎(chǔ),由于脂質(zhì)成分不溶于水但能被乙醚、石油醚、氯仿、苯等有機(jī)溶劑抽提出,本研究中根據(jù)其特性萃取方法進(jìn)行了優(yōu)化,其中乙醚溶解脂肪的能力強(qiáng),應(yīng)用最多,但現(xiàn)在對于乙醚安全管制嚴(yán)格,而石油醚溶解脂肪的能力僅比乙醚弱些,且來源方便,且含水分比乙醚少,沒有乙醚易燃故在萃取脂質(zhì)方法中將選取石油醚有機(jī)溶劑作為萃取試劑,同時,石油醚在研究用途上主要用作溶劑和油脂處理,石油醚本身屬于無色透明液體,在萃取離心后,能有效分層,提高分辨率[11]。

二維薄層色譜法操作是首先在一個方向?qū)⒒旌衔镞M(jìn)行色譜分離,將紙干燥后,再將混合物用另一種溶劑在與第一個方向的垂直方向進(jìn)行第二次色譜分離,使用不同溶劑進(jìn)行雙向展開,相對于單向薄層色譜,二維薄層色譜法的分離效率大大提高,且重復(fù)性更穩(wěn)定[12]。由于TAG與PDIM極性較小,故展開劑系統(tǒng)A選用石油醚∶乙酸乙酯系統(tǒng)和石油醚∶丙酮系統(tǒng);同理,在系統(tǒng)B中DAG等脂質(zhì)的極性相對較小,故展開劑也使用石油醚∶丙酮系統(tǒng);而游離脂肪酸與游離分枝菌酸極性較前兩系統(tǒng)的大,為了更有效的展開成分,故在第一個方向的展開劑的選擇上選取氯仿∶甲醇系統(tǒng);另外,由于兩次展開都在同一塊薄層板上進(jìn)行,倘若第一維展開劑中含水,則干燥過程將十分耗時,且很難控制薄層板的含水量,故建議將含水較多的展開劑放在第二維,以確保方法的重現(xiàn)性,因此在展開劑系統(tǒng)D中含水量較多的氯仿：丙酮∶甲醇∶水系統(tǒng)將放在第二維。

本試驗通過建立的萃取方法分離了分枝桿菌的非極性脂質(zhì)以及通過二維薄層色譜法分析脂質(zhì)成分,其中可能包括為三酰甘油(Triacylglycerols,TAG)、甲硫酚二角酰亞胺(Phthiocerol dimycocerosates,PDIM)、家族蛋白PAT(Perilipin adipophilinTIP47)、甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)、游離脂肪酸(FREE FATTY ACID,FFA)、游離分枝菌酸(FREE MYCOLIC ACID,FMA)、硫脂 I類(Sulphatides-I,SL-I)、硫脂 III類(Sulphatides-III,SL-III)、葡萄糖單霉菌酸酯(Glucose esters single mold,GMM)、海藻糖二霉菌酸酯(Trehalose esters double mold,TDM)。

根據(jù)BCG-pasteur以及mc2155薄層色譜法結(jié)果,本試驗建立的萃取方法以及展開劑系統(tǒng)具有可重復(fù)性,能準(zhǔn)確萃取以及分析分枝桿菌中的非極性脂質(zhì)成分,研究結(jié)果顯示,mc2155細(xì)菌中含有脂質(zhì)成分占比明顯低于BCG-pasteur的細(xì)胞壁脂質(zhì)成分。恥垢分枝桿菌屬革蘭陽性腐生菌,具有快速生長特點,且無致病性,有研究表明,恥垢分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌基因高度同源、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似等特點[13],這由于兩者的基因雖高度同源,但其仍具有差異之處,這在一定程度上影響了各脂質(zhì)部分的含量以及組成,另外研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞壁脂類與潛在的結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制和宿主防御過程具有關(guān)聯(lián)性,而兩者脂質(zhì)成分的差異以及含量不同與此觀點相呼應(yīng)[14]。本試驗結(jié)果可見不同分枝桿菌脂類存在較大的差異,通過我們的試驗可以找到具有保護(hù)作用的脂質(zhì)成分,能夠以恥垢分枝桿菌為疫苗載體表達(dá)其結(jié)核分枝桿菌或者卡介苗中抗原特異性脂類成分,從而提高其免疫原性,可能為一種新的牛結(jié)核疫苗研究提供思路,同時這些差異較大的脂質(zhì)成分也可以作為新的免疫佐劑用以提高卡介苗的免疫保護(hù)效果。