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        糖通飲對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用*

        2019-07-18 11:58:56高楠楠侯勝開屈璐潘艷伶
        貴州醫(yī)科大學學報 2019年6期
        關(guān)鍵詞:貝沙坦灌胃尿蛋白

        高楠楠, 侯勝開, 屈璐, 潘艷伶,2**

        (1.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院 中醫(yī)學教研室, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

        中國人群中糖尿病(dabetes mellitus,DM)的總患病率為11.6%,約1/3會發(fā)展為糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN),這是DM最嚴重的并發(fā)癥之一,存在發(fā)生進展性腎病的高風險[1]。DN患者早期表現(xiàn)為不同程度的蛋白尿和腎小球高濾過,進而出現(xiàn)腎小球萎縮、腎小管細胞外基質(zhì)堆積和基底膜增厚等情況,最終可發(fā)展為慢性腎功能不全[2]。一旦發(fā)展至終末期腎臟病,病情將不可逆轉(zhuǎn),最終危及患者生命安全[3]。因此早期診斷和治療DN是預防腎臟損害、延緩病情的關(guān)鍵所在。本實驗通過觀察早期DN大鼠的空腹血糖(FBG)、血清肌酐(SCr)、24 h尿蛋白定量及腎臟組織的病理形態(tài)學的改變,探討糖通飲對早期DN大鼠腎臟的保護作用,為臨床用藥提供科學依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物、主要儀器及試劑

        1.1.1實驗動物 健康SPF級雄性SD大鼠55只,體質(zhì)量(180±20)g,由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供[許可證號為SCXK(黔)2002-0001]。

        1.1.2主要藥品、試劑及儀器 糖通飲(由生地黃、山藥、山萸肉、茯苓、澤瀉等10味中藥組成)由貴州醫(yī)科大學附院提供,鏈脲佐菌素(STZ)由美國Sigma公司生產(chǎn),厄貝沙坦片(科蘇)由揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司生產(chǎn),BCA蛋白濃度測定試劑盒由北京索萊寶公司提供,血清(SCr)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。主要儀器:強生穩(wěn)豪型血糖測試儀[強生(中國)有限公司]、ACS-LEAS電子計重秤、BIO96孔酶標板、 TDL-5-A型臺式大容量離心機、Leica TP1020半自動脫水機、Leica EG1150H包埋機、Leica CM2245輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機、BioTek-SYNERGYH4酶標儀等。

        1.1.3樣品前處理 糖通飲加適量雙蒸水,用專用的器皿進行熬制,熬制90 min,生藥含量濃縮至1 000 g/L,藥物冷卻后置于4 ℃冷藏保存。

        1.2 方法

        1.2.1動物模型復制方法 SPF級雄性SD大鼠55只,普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常組(A組)10只、造模組45只。造模組給予高脂高糖飼料(普通飼料+50%豬油+1%膽固醇+0.2%膽鹽+20%糖)喂養(yǎng)6周,造模前禁食(不禁水)12 h,SD大鼠稱重后,給予1% STZ的檸檬酸緩沖液(pH 4.5)按20 mg/kg首次劑量腹腔注射,此后每隔72 h注射1次STZ(共需注射2次或3次),且在首次劑量的基礎上增加5 mg/kg劑量;正常組給予同等劑量的檸檬酸鈉緩沖液,大鼠于每次注射72 h后尾靜脈取血測FBG,當血糖值≥16.7 mmol/L,且飲水量和尿量明顯增多,則判定為DM模型選模成功。模型建立后,繼續(xù)予高脂高糖飼料喂養(yǎng),3周后代謝籠收集24 h尿液,24 h尿蛋白≥30 mg[4],即判定為DN模型造模成功。

        1.2.2分組及給藥 將造模成功的40只DN大鼠隨機分為模型組(B組)10只,糖通飲組(C組)10只,厄貝沙坦組(D組)10只及糖通飲+厄貝沙坦組(E組)10只。C組糖通飲煎劑[按12 g/(kg·d)]給予灌胃治療(大鼠用量按人與動物體表面積的等效比值表折算),間隔6 h再次給予等量生理鹽水灌胃1次,連續(xù)給藥8周;D組厄貝沙坦片[按照13 mg/(kg·d)]稀釋于7.5 mL生理鹽水中給予灌胃治療(大鼠用量按人與動物體表面積的等效比值表折算),間隔6 h再次給予等量生理鹽水灌胃1次,連續(xù)給藥8周;E組給予糖通飲煎劑[按12 g/(kg·d)]灌胃治療,間隔6 h再次給予厄貝沙坦片[按13 mg/(kg·d)]懸濁液灌胃1次,連續(xù)給藥8周;A、B組均給予等量的生理鹽水灌胃,每日2次,連續(xù)灌胃8周。

        1.2.3標本收集 各組大鼠灌胃8周后,禁食(不禁水)12 h,置于代謝籠中收集24 h尿液,尾靜脈取血測FBG;電子天平稱量體質(zhì)量,按0.3 mL/100 g體質(zhì)量給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉動物,腹主動脈取血,摘除大鼠右側(cè)腎臟,生理鹽水沖洗,置于4%多聚甲醛溶液中固定。

        1.3 指標測定

        1.3.1FBG、SCr、24 h尿蛋白檢測 尾靜脈收集的血液標本檢測FBG。鼠籠收集的24 h尿液過濾沉渣、量體積后置離心機上3 000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液,雙辛丁酸法(BCA)檢測24 h尿蛋白。腹主動脈取血,冰上靜置30~60 min,3 000 r/min,4 ℃離心15 min,取上清液,肌氨酸氧化酶法檢測SCr。

        1.3.2蘇木素-伊紅(HE)染色 將4%多聚甲醛溶液固定的大鼠腎臟常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片;將切好的片子置于65 ℃烘箱進行烤片45 min,二甲苯脫蠟后下行脫水,洗滌5 min,蘇木素染液染色8 min,沖洗至水清,1%HCl酒精快速分化3 s,伊紅染色3 min,沖洗至水清、脫水、透明、封片,光鏡下觀察并拍照。

        1.4 統(tǒng)計學方法

        2 結(jié)果

        2.1 一般資料

        45只SD大鼠造模,死亡5只;由于實驗周期較長,在此期間B組出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥死亡3只,灌胃治療時E組由于藥物不耐受死亡4只,D組死亡3只,C組死亡2只,最終納入結(jié)果分析的總共38只SD大鼠。

        2.2 FBG、SCr及24 h尿蛋白水平

        與A組比較,B組的FBG、SCr及24 h尿蛋白明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與B組比較,C、E組的FBG、SCr及24 h尿蛋白明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);D組的SCr和24 h尿蛋白較B組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),F(xiàn)BG差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 見表1。

        組別nFBG(mmol/L)SCr(μmol/L)尿蛋白(mg/24 h)A組105.24±0.33 41.28±5.29 26.90±8.22 B組727.10±1.29(1)113.78±25.42(1)132.87±39.69(1)C組822.82±3.02(2)72.49±22.01(2)98.60±13.95(2)D組725.05±2.3666.33±19.93(2)99.53±33.83(2)E組620.93±4.28(2)65.39±22.10(2)83.17±30.05(2)

        (1)與A組比較,P<0.01;(2)與B組比較,P<0.05

        2.3 腎臟組織形態(tài)學

        A組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)排列整齊,腎小球、腎小管未見明顯異常;B組大鼠腎臟組織的病理形態(tài)結(jié)構(gòu),表現(xiàn)出明顯的腎小球基底膜增厚、細胞外基質(zhì)積聚、腎間質(zhì)纖維化;與B組比較,C、D、E組治療后上述病理改變均明顯減輕。見圖1。

        3 討論

        DN是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一,也是全球終末期腎功能衰竭的主要原因[5-6]。DN最常見的臨床表現(xiàn)是蛋白尿,病理特征是腎小球纖維化,基底膜增厚,細胞外基質(zhì)積聚等。正常的腎臟具有屏蔽蛋白質(zhì)的作用,當腎臟出現(xiàn)異常,腎小球受損,蛋白質(zhì)通過率增加,尿液中蛋白含量亦隨之增加,從而出現(xiàn)大量蛋白尿[7]。蛋白尿的形成與腎臟血流動力學改變引起的系膜基質(zhì)擴展和基底膜增厚等腎間質(zhì)纖維化病理改變密切相關(guān)[8]?,F(xiàn)代臨床醫(yī)學研究中對其發(fā)病機制尚未明確。但有研究指出,DN發(fā)病機制包括遺傳因素,氧化應激,血液動力學因子等[9]。目前,現(xiàn)代醫(yī)學主要采用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素受體阻斷劑(ARBs)兩類藥物對腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)進行阻斷[10]。雖然DN病情得到一定程度的延緩或控制,但因其單用時存在較多不良反應,影響DN的治療效果[11]。近年來中醫(yī)藥憑借副作用少、毒性低等優(yōu)勢在預防DN等方面受到廣泛關(guān)注[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)糖腎I號、自擬益氣活血方、三七皂苷等均能顯著降低DN大鼠的血糖值,減少蛋白尿的排出[14]。亦有學者發(fā)現(xiàn)清熱益氣通絡方能夠降低DN大鼠的24 h尿蛋白,且效果優(yōu)于厄貝沙坦[15]。

        圖1 各組大鼠腎臟組織染色結(jié)果(HE,×400)Fig.1 Histological changes of kidneys in each group

        古代醫(yī)書中并無“糖尿病腎病”此稱,后世醫(yī)家將其歸屬于“消渴”、“尿濁”等范疇。本實驗選方糖通飲,是由全國名老中醫(yī)凌湘力教授根據(jù)多年治療糖尿病的臨床經(jīng)驗所擬的經(jīng)驗方,凌教授認為DN屬于消渴變證,是以氣陰兩虛為本、瘀血阻絡為標[16]。氣虛導致血運無力,陰虧導致血行不暢,久病成瘀,瘀血阻絡,損傷腎絡;同時凌教授認為瘀血是DN發(fā)生發(fā)展最主要的病理產(chǎn)物[17]。本藥方在六味地黃丸的基礎上配伍黃芪、丹參、地骨皮、草決明而成,具有益氣養(yǎng)陰保腎、活血化瘀通絡之功[18]?,F(xiàn)代藥理學研究證明,六味地黃丸能夠抑制氧化應激反應,上調(diào)細胞紅蛋白的表達,從而預防腎纖維化和保護腎小球系膜細胞[19]。黃芪及其提取物能有效減少空腹血糖和蛋白尿水平,降低纖維化,從而保護腎臟,改善全身狀態(tài)[20]。丹參能夠抗氧化、降血糖、改善腎組織纖維化程度,保護腎臟,延緩慢性腎臟疾病的進展[21]。有文獻指出地骨皮不僅能夠降血糖, 還可用于降血壓、降血脂[22]。草決明亦在降血壓、抗氧化、降血脂等多方面療效顯著[23]。

        本實驗結(jié)果顯示,糖通飲與能夠有效地減少早期DN大鼠的24 h尿蛋白,降低FBG和SCr水平;厄貝沙坦片雖具有降低SCr和24 h尿蛋白的作用,但其降糖效果不明顯,而兩者聯(lián)合應用時,降糖效果優(yōu)于厄貝沙坦單獨應用;腎臟組織形態(tài)學方面,糖通飲可以減輕早期DN大鼠腎小球細胞外基質(zhì)積聚、腎小球基底膜增厚情況,改善腎臟纖維化狀態(tài),從一定程度上延緩早期DN發(fā)展至終末期腎病的進展,為名老中醫(yī)經(jīng)驗方糖通飲的臨床推廣及應用提供科學的理論依據(jù)。

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