張軍波， 呂穎， 韓穩(wěn)琦， 劉仲偉， 潘軍強， 王軍奎

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 周圍血管科， 陜西 西安 710061； 2.陜西省人民醫(yī)院&西安交通大學(xué)第三附屬醫(yī)院 心內(nèi)科， 陜西 西安 710068)

流行病學(xué)研究表明，高血壓是一種年齡相關(guān)疾病，除引起血壓升高外，還會導(dǎo)致左心室重構(gòu)等靶器官損害，高血壓與左心室肥厚(left ventricular hypertension，LVH)均是心血管疾病發(fā)病和死亡的主要危險因素[1]。在心血管系統(tǒng)，循環(huán)血液及局部組織中均存在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)，有證據(jù)表明局部RAS較循環(huán)RAS對高血壓發(fā)生、發(fā)展及其靶器官損害有著更為重要的作用。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是血管局部RAS中最主要的效應(yīng)活性肽，主要通過2個血管緊張素受體(angiotensin receptor，ATR)亞型【 Ⅰ型(angiotensin receptor-1，AT1)和Ⅱ型(angiotensin receptor-1，AT2)】發(fā)揮作用。AngⅡ與AT1結(jié)合后，主要發(fā)揮血管收縮和促醛固酮分泌的作用，還能刺激產(chǎn)生細胞因子，促進細胞增殖、促纖維化和促炎癥反應(yīng)；AT2的作用與AT1相反，過度表達的AT2起著對抗AT1介導(dǎo)的生物效應(yīng)，包括血管舒張、抑制增殖等[3]。ATR在線粒體、細胞核或細胞膜的相對表達，決定了局部RAS激活后的病理生理效應(yīng)[4]。本研究通過探析不同年齡自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心肌局部AT1、AT2及二者比例與心肌結(jié)構(gòu)重塑的關(guān)系，從而為老年高血壓患者心肌肥厚的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑儀器

60只雄性SHR大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供)均分為幼年組(7周齡)、成年組(26周齡)及老年組(51周齡)，每組各20只。AT1及AT2一抗由美國ADI4生物制劑公司生產(chǎn)，SA1022即用型兔二抗SABC免疫純化試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純級。儀器RBP-I 型大鼠血壓心率測定儀由中日友好醫(yī)院臨床研究所生產(chǎn)，QWin550CW圖像系統(tǒng)由德國萊卡公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1循環(huán)血漿中AngⅡ濃度測定 所有大鼠自由飲水，每12 h光暗循環(huán)1次，溫度18～25 ℃，濕度45%～65%，氨濃度<20 mg/L，換氣量為1.27 m/h。各組SHR大鼠預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)1周，稱取體質(zhì)量(Body Mass，BM)，苯巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后從腹主動脈抽取血液4～5 mL至試管中，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min后取上層血漿，-70 ℃冰箱保存；取0.5 g心肌低溫勻漿后，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min；ELISA法測以上樣品中AngII含量，雙孔法取平均值。

1.2.2心室肌標本的取材及膠原纖維和ATR的檢測 4%多聚甲醛灌注取材，取左心室固定24 h，石蠟包埋切片，Mallory染色觀察膠原纖維，免疫組化SABC法(一抗1∶50，二抗1∶200)測定AT1和AT2表達。采用QWin550CW圖像系統(tǒng)進行采集與分析，測Mallory染色下藍色膠原纖維的累積光密度值(integral optical density，IOD)。對于免疫組化SABC法染色，測定的ATR蛋白表達水平以每個視野的陽性物質(zhì)的灰度值(gray density，GD)表示，在高倍鏡下選3個視野，測定每個視野的陽性物質(zhì)的GD。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血漿及心室肌局部AngⅡ

3組SHR大鼠循環(huán)血漿AngⅡ含量隨年齡增加而升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，心室肌勻漿AngⅡ含量隨年齡增加而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組SHR大鼠血漿及心室肌組織AngⅡ的表達Tab.1 Plasma and the myocardial tissue AngⅡ expression of three groups SHR

(1)與幼年組比較，P<0.01；(2)與成年組比較，P<0.01

2.2 心肌纖維化

3組SHR大鼠心肌IOD(IOD的大小與纖維化程度正相關(guān))隨年齡增加而增加，老年組(348±27)>成年組(163±18)>幼年組(90±20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；且心肌膠原纖維沉積隨年齡增加而明顯增加，尤其在老年組；見圖1。老年組Mallory染色可見心肌組織間冠狀動脈中膜增厚、纖維化，管腔變小，見圖2。

幼年組 成年組 老年組注：紅色為心肌細胞，藍色為膠原纖維沉積圖1 各組SHR大鼠心室肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)果(Mallory染色，×100)Fig.1 Myocardial Histology of three SHR groups

圖2 老年組SHR心肌內(nèi)冠狀動脈重構(gòu)(Mallory染色，×100)Fig.2 Myocardial coronary remodeling in the elderly group

2.3 心肌ATR表達

免疫組化及蘇木素復(fù)染圖片中，圖像顏色越深，代表蛋白表達量越高，而GD值也越小。結(jié)果提示AT1及AT2在各年齡組的表達有差異：左室心肌中AT1的GD值隨年齡增加而降低，GD值在幼年組均高于成年及老年組(P<0.05，或<0.01)，成年組高于老年組(P<0.05)，AT2的GD隨年齡的增加而增加，幼年組均低于成年及老年組(P<0.05)，成年組與老年組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；老年組和成年組的AT1/AT2值均低于幼年組(P<0.01)，但成年組大鼠與老年組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2和圖3。

表2 各組SHR心肌ATR表達Tab.2 Comparison of IOD value of Mallory staining in three SHR groups

與幼年組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01；(3)與成年組比較，P<0.05

注：A、D為幼年組， B、 E為成年組， C 、F為老年組；A、B、C為AT1，D、E、F為AT2，圖象顏色深度越淺，表示蛋白的表達越少圖3 各組SHR大鼠心室肌細胞AT1及AT2表達(蘇木素染色，×100) Fig.3 Expression of AT1 and AT2 in cardiomyocytes in all groups

3 討論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高鹽負荷能顯著增加心肌、主動脈及腸系膜上動脈壁局部AT1和AT2表達，在血管中以中等直徑的腸系膜上動脈壁改變較為顯著[5-6]，血管局部的AT1和AT2也隨著年齡增加有一定的改變[7]。本研究發(fā)現(xiàn)老年組SHR大鼠心室肌纖維化增加，血漿AngⅡ含量隨年齡增高無明顯變化，心肌勻漿中AngⅡ含量隨年齡增加而升高，提示局部RAS表達改變對于心肌纖維化的作用可能較循環(huán)RAS更為重要。

30 d和100 d Ren-2轉(zhuǎn)基因大鼠腹腔注射抗AT1藥物，除降壓作用外，還可減少心肌肥厚，大幅度改善血管緊張素依賴性血管收縮[8]。線粒體對所有組織代謝和細胞凋亡起到關(guān)鍵作用，特別是在老齡化過程中，已有報道在腎皮質(zhì)、心肌細胞的線粒體中存在AT1，幼齡動物線粒體AT1水平很低，隨著年齡增長其在核及線粒體表達顯著增加[9]。

AT2在大鼠心肌細胞線粒體膜高表達[10]，并在胚胎期高表達，出生后迅速下降；在高血壓等病理狀態(tài)下，成年大鼠局部心肌AT2的增高可能繼發(fā)于AT1的增高，發(fā)揮一定的代償作用。相較AT1，線粒體中AT2表達隨年齡增長逐步降低。與本研究相似，Gwathmey等[9]發(fā)現(xiàn)年輕大鼠腎細胞中AT2占ATR的80%，隨著年齡的增加，AT1占85%，線粒體中AT2隨年齡增加而減少，長期服用血管緊張素受體拮抗劑后可以在體內(nèi)恢復(fù)二者平衡，增加線粒體AT2表達。

心臟中成纖維細胞約占到心肌結(jié)構(gòu)的2/3，心肌的細胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成，尤其是前者占心肌間質(zhì)總膠原比重超過80%。心肌纖維化是心臟老化的一個重要特征，心肌間質(zhì)纖維化會引發(fā)心肌結(jié)構(gòu)紊亂、僵硬度增加、心臟順應(yīng)性降低、心律失常發(fā)生率增高，是心肌異常僵硬的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[11]。一些臨床研究已證實，高血壓患者除心肌重構(gòu)外，心肌內(nèi)小的冠狀動脈也發(fā)生了結(jié)構(gòu)重構(gòu)，中膜厚度/管腔比率增大和纖維化[12]。纖維化亦是高血壓患者冠脈血管舒張能力受到損害的主要因素。

因GD值與心肌細胞圖象顏色深度呈反相關(guān)，因此本研究中AT1表達隨年齡增加而升高，AT2表達隨年齡增加而降低，導(dǎo)致AT1/AT2比值持續(xù)變小，同時心肌膠原纖維沉積明顯增加，尤其是老年組。中年組與老年組AT2無進一步減少，甚至有增加的趨勢，可能與血壓和局部AngⅡ增加將上調(diào)AT2的表達有關(guān)[13]。此外，一系列體外實驗顯示，局部RAS對心肌存在獨立于血壓外的重構(gòu)作用，組織纖維化發(fā)生可不依賴于血壓升高[14]。成纖維細胞的激活與增生是導(dǎo)致年齡增長過程中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)過度表達和膠原沉積的原因[15]，AngⅡ和TGF-β1增加抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶活性，刺激蛋白酶抑制劑的表達，導(dǎo)致膠原纖維的降解減少，促使心肌纖維化[11]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示心肌局部AT1、AT2及二者比例的改變可能是由于年齡增長導(dǎo)致心肌重塑、膠原沉積的機制之一，提示防治高血壓年齡增加過程中的心肌纖維化對維持正常心臟結(jié)構(gòu)具有重要的意義。