馬幫靖， 郝翔麟， 韓飛， 劉晉祎， 曹佳***， 張愛華*

(1.貴州醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院 衛(wèi)生毒理學教研室， 貴州 貴陽 550004； 2.陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學) 軍事預防醫(yī)學院 毒理學研究所， 重慶 400038)

肺癌是全球男性、發(fā)達國家女性癌癥死亡的首要原因[1]，也是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[2-3]，嚴重威脅著人們的健康和生命。盡管肺癌的篩查和綜合診療技術不斷改進，但肺癌患者5年生存率仍較低[4-5]。肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機理尚不十分清楚，對其深入研究、篩選新的診斷標志物與治療靶點，有利于改善肺癌的預防、診療及預后。SOX30是SOX基因家族H亞族的唯一成員，在雄性生殖系統(tǒng)中起重要作用[6-7]，本課題組研究發(fā)現(xiàn)SOX30是肺癌的一個新抑癌基因，它能通過調(diào)控p53表達抑制肺癌細胞增殖、誘導肺癌細胞凋亡，與肺腺癌患者預后相關[8-9]。最近研究還發(fā)現(xiàn)SOX30能夠抑制肺癌的侵襲和遷移，但分子機制尚不清楚。對SOX30調(diào)控基因數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)SOX30與橋粒蛋白基因PKP2表達顯著相關。已有研究發(fā)現(xiàn)，PKP2與腫瘤的生長、侵襲和遷移有關，在口咽腫瘤[10]、膀胱癌[11]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[12]、胃癌[13]、乳腺癌[14]中均有相關報道。推測SOX30與PKP2在肺癌中可能存在表達調(diào)控關系，并且通過PKP2發(fā)揮抑癌作用。因此，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)、轉錄結合位點預測、SOX30差異表達細胞模型和基因敲除動物模型，分析SOX30對PKP2表達的影響，分析二者在肺癌中的表達調(diào)控關系，為進一步研究二者在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制提供資料。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

1.1.1細胞株 HBE、A549、H460、H520、H358、H1975、SPC-A1、95D及LTEP細胞株均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，前期已將H460及H520細胞轉染SOX30表達載體成功構建H460-SOX30及H520-SOX30穩(wěn)轉細胞系。

1.1.2SOX30基因敲除小鼠SOX30基因敲除小鼠由南京大學模式動物研究所構建，品系為C57BL6，飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心(SPF級)，由本室繁殖維護，利用PCR對新生小鼠基因型進行鑒定。動物實驗遵循倫理學要求。

1.1.3主要試劑及儀器 胎牛血清、胰酶、F-12K及RPMI-1640培養(yǎng)基均購自Gibco公司，總RNA提取試劑TRIzol Reagent購自Invitrogen，GoScriptTM逆轉錄試劑盒(A5001)及2×GoTaq?qPCR Green Master Mix 購自Promega，Western及IP細胞裂解液(P0013)、PMSF(ST506)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012)、SDS-PAGE配膠試劑盒(P0012A)均購自碧云天生物技術研究所，SOX30抗體及PKP2抗體均購自Santa Cruz，普通RT-PCR儀、CFX96 qRT-PCR儀、蛋白電泳儀和轉膜儀均購自美國Bio-Rad Laboratories。

1.2 方法

1.2.1臨床標本數(shù)據(jù)來源及熱圖繪制 肺癌中SOX30與PKP2基因的表達數(shù)據(jù)下載于UCSC Xena(網(wǎng)址：https://xenabrowser.net)，SOX30基因表達數(shù)據(jù)集及PKP2基因表達數(shù)據(jù)集ID均為TCGA.LUNG. sampleMap/HiSeqV2。通過提取SOX30、PKP2基因表達信息數(shù)據(jù)并進行相應的數(shù)據(jù)匹配獲得具有SOX30、PKP2基因表達信息的非小細胞肺癌與癌旁組織1 129例，肺腺癌與癌旁組織571例，肺鱗癌與癌旁組織553例。肺癌組織與癌旁組織中SOX30與PKP2的表達熱圖于網(wǎng)站https://genome-cancer.ucsc.edu/proj/site/hgHeatmap/在線繪制。

1.2.2SOX30轉錄結合位點預測 于網(wǎng)站http://jaspar.binf.ku.dk/在線預測PKP2啟動子區(qū)SOX30轉錄結合位點。

1.2.3細胞培養(yǎng) HBE、H460、H520、H358、H1975、SPC-A1、95D及LTEP細胞株及H460-SOX30、H520-SOX30穩(wěn)轉細胞系使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，A549細胞使用含10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基，所有細胞均培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的常規(guī)培養(yǎng)箱中，均采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，所有實驗用細胞均為對數(shù)生長期細胞。

1.2.4RNA提取及cDNA合成 各細胞株的RNA提取均采用TRIzol 提取法,測定RNA濃度和純度后參照GoScriptTM逆轉錄試劑盒(A5001)說明書合成cDNA。SOX30基因敲除小鼠肺組織進行液氮研磨后參照上述方法提取總RNA、合成cDNA。

1.2.5qRT-PCR檢測 合成引物：(1)SOX30引物，上游序列AAACCAAAGATGTCCCGCTCAC，下游序列GGTCGCTTCACATGACCATTT；(2)PKP2引物，上游序列GTGGGCAACGGAAATC TTCAC，下游序列CCAGCCTTTAGCATGTCATAGG；(3)β-Actin引物，上游序列:CCACGAAACTACCTTCAACTCC，下游序列GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT。qRT-PCR反應體系(20 μL)：上游引物(F)1 μL，下游引物(R)1 μL，2×GoTaq?qPCR GreenMaster Mix 10 μL，cDNA模板200 ng，Nuclease-free water補足至20 μL。β-Actin作為內(nèi)參基因。qRT-PCR程序如下：(1)95 ℃，3 min；(2)95 ℃，15 s；(3)60 ℃，30 s；(4)返回第(2)步，40個循環(huán)；(5)65.0 ℃逐漸上升到95 ℃，每5 s上升0.5 ℃，結束。本實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計算PKP2在不同細胞或組織中的相對表達量，并使用算得的相對值在Graphpad prism 6 軟件中繪圖。

1.2.6蛋白提取及Western Blot檢測 H460-SOX30及H520-SOX30穩(wěn)轉系細胞融合度達90%時，用細胞裂解液裂解細胞后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量，配平后按1體積蛋白加1/4體積5×loading buffer(上樣緩沖液)配成混合液,混勻后于100 ℃加熱5 min變性，配制10%的SDS-PAGE膠，每孔總蛋白上樣量為40 μg。80 V恒壓電泳2 h，之后4 ℃冷庫80 V恒壓轉膜2 h，接著3%的BSA室溫封閉1 h，一抗(兔抗SOX30按1:800稀釋、PKP2按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。次日取出，TBST洗膜10 min×3次，然后二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。最后使用VILBER公司的FUSION FX5 specra成像系統(tǒng)，滴加顯影劑進行曝光，保存圖片。本實驗重復3次，圖片使用Image J 軟件進行灰度分析，以灰度值大小間接反映蛋白含量，并使用Graphpad prism 6 軟件繪圖。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 SOX30與PKP2在肺癌中的關系

首先利用TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析了SOX30與PKP2在非小細胞肺癌中的表達相關性，結果表明二者在非小細胞肺癌中表達呈正相關(圖1A)。盡管SOX30基因與PKP2基因在非小細胞肺癌中的表達有相關性，但是相關系數(shù)較小，為此進一步分析了非小細胞肺癌主要亞型肺腺癌與肺鱗癌中二者的表達相關性，結果顯示二者在肺腺癌中表達呈正相關(圖1B)，在肺鱗癌中表達不相關(圖1C)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫肺癌基因表達Fig.1 The gene expression heat map of lung cancer from TCGA database

2.2 SOX30基因可能轉錄調(diào)控PKP2基因的表達

為了進一步證實SOX30蛋白可能調(diào)控PKP2基因的表達，利用JASPAR 數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.binf.ku.dk)對SOX30蛋白在PKP2基因啟動子區(qū)的潛在的轉錄結合位點進行了預測，結果發(fā)現(xiàn)在PKP2基因啟動子區(qū)存在多個SOX30蛋白轉錄結合位點(表1)，提示SOX30很可能轉錄調(diào)控PKP2的表達。

表1 PKP2啟動子區(qū)SOX30蛋白轉錄結合位點預測Tab.1 The prediction of SOX30 transcription binding sites in PKP2 promoter region

2.3 PKP2在HBE及8株肺癌細胞中的表達

為了證實PKP2在HBE及肺癌細胞中的表達情況，檢測了這些細胞株中PKP2 mRNA表達水平，結果發(fā)現(xiàn)PKP2在HBE細胞中有較高表達，8株肺癌細胞中PKP2 mRNA水平相對HBE均呈下調(diào)趨勢(圖2)，這與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的SOX30基因在肺癌細胞中總體表達下降一致[8]。

圖2 各肺癌細胞株中PKP2 mRNA表達情況Fig.2 The mRNA expression levels of PKP2 in lung cancer cell lines

2.4 過表達SOX30上調(diào)PKP2基因的表達

為進一步確定肺癌中SOX30對PKP2具有表達調(diào)控關系，利用肺癌細胞株H460和H520構建了SOX30高表達細胞模型，利用qRT-PCR和Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，在H460細胞中SOX30高表達后顯著上調(diào)PKP2的mRNA及蛋白水平(圖3)，而在肺鱗癌細胞H520中過表達SOX30后PKP2的mRNA及蛋白水平未見顯著變化(圖4)，這與SOX30與PKP2在臨床肺鱗癌中表達不相關一致。

注：A為PKP2 mRNA表達水平，B、C、D為SOX30及PKP2蛋白表達水平，Vector代表空載質(zhì)粒；(1)與Vector比較，P<0.01圖3 H460-SOX30穩(wěn)轉細胞系中PKP2 mRNA及蛋白表達水平Fig.3 The levels of mRNA and protein of PKP2 in the H460-SOX30 stably transfected cells

注：A為PKP2 mRNA表達水平，B、C、D為SOX30及PKP2蛋白表達水平，Vector代表空載質(zhì)粒；(1)與Vector比較，P<0.001圖4 H520-SOX30穩(wěn)轉細胞系中PKP2 mRNA及蛋白表達水平Fig.4 The levels of mRNA and protein of PKP2 in the H520-SOX30 stably transfected cells

2.5 敲除SOX30對PKP2表達的影響

為了確定SOX30對PKP2表達調(diào)控的重要作用，進一步利用SOX30基因敲除動物模型，檢測了小鼠肺組織中PKP2 mRNA表達情況，結果發(fā)現(xiàn)純合子(SOX30-/-)小鼠肺組織中PKP2 mRNA表達水平顯著低于雜合子(SOX30+/-)及野生型(SOX30+/+)小鼠(圖5)，表明SOX30對PKP2基因的表達起著重要的調(diào)控作用。

(1)與SOX30-/-比較，P<0.01圖5 SOX30基因敲除小鼠肺組織中PKP2 mRNA表達水平Fig.5 The mRNA levels of PKP2 in the lung tissues of the SOX30 gene knockout mice

3 討論

Plakophilins蛋白家族包括Plakophilin 1(PKP1)、Plakophilin 2(PKP2)及Plakophilin 3(PKP3)，是細胞黏附分子p120ctn家族的成員，分子結構中具有特征性的Armadillo重復序列(含45個氨基酸)，且與p120ctn該序列的相似性約為50%。Plakophilins蛋白主要定位于橋粒，對細胞橋粒的組成及功能維持有重要作用。研究表明PKP2是唯一在心臟表達的Plakophilin 蛋白，是心肌細胞胞間黏附所必需的；PKP2的突變是致心律失常性右室心肌病發(fā)病的主要原因[15-17]。眾多研究也表明PKP2參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Papagerakis等[10-12]研究發(fā)現(xiàn)PKP2在口咽腫瘤轉移癌組織、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達，與腫瘤的增殖、侵襲、遷移有關；但在胃癌中PKP2的表達顯著下調(diào)[13]，而乳腺癌中PKP2的表達與正常配對組織相比并無顯著差異[14]，而且與患者的臨床病理特征也無相關性，表明不同類型腫瘤中PKP2的表達及功能不同。但是，PKP2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機制及作用機制還不清楚。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SOX30與PKP2在肺腺癌中表達正相關，在肺鱗癌中表達不相關。本實驗室前期的研究顯示，SOX30是肺腺癌中的一個典型抑癌基因，其高表達有利于患者預后，而在肺鱗癌中并無顯著的抑癌作用[9]，因此，SOX30與PKP2表達僅在肺腺癌中相關與SOX30基因功能一致。隨后發(fā)現(xiàn)在PKP2啟動子區(qū)存在多個SOX30蛋白轉錄結合位點，提示SOX30很可能轉錄調(diào)控PKP2的表達。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，在肺癌細胞中PKP2 mRNA水平較HBE呈下調(diào)趨勢，與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SOX30在肺癌細胞株中普遍低表達的趨勢一致，初步確定二者在肺癌中存在表達相關性[8]。為證實二者在肺癌中的表達調(diào)控關系，進一步檢測了H460-SOX30及H520-SOX30穩(wěn)轉細胞系中PKP2的表達情況，發(fā)現(xiàn)過表達SOX30將顯著提高H460細胞中PKP2的表達水平，但在肺鱗癌細胞H520中未見明顯變化，這與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果一致，表明SOX30與PKP2在肺鱗癌中表達不相關。更為重要的是，敲除SOX30基因后，小鼠肺組織中PKP2 mRNA表達顯著下調(diào)，進一步表明SOX30對PKP2的表達有關鍵調(diào)控作用。

綜上所述，本研究初步表明SOX30是PKP2基因轉錄調(diào)控的關鍵分子，SOX30-PKP2可能在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。后續(xù)需要進一步利用體內(nèi)外實驗結合肺癌臨床樣本，進一步探討二者的調(diào)控關系和抑癌分子機制，為深入了解SOX30、PKP2基因的功能提供資料。