馬幫靖， 郝翔麟， 韓飛， 劉晉祎， 曹佳***， 張愛(ài)華*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生毒理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué)) 軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院 毒理學(xué)研究所， 重慶 400038)

肺癌是全球男性、發(fā)達(dá)國(guó)家女性癌癥死亡的首要原因[1]，也是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[2-3]，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命。盡管肺癌的篩查和綜合診療技術(shù)不斷改進(jìn)，但肺癌患者5年生存率仍較低[4-5]。肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理尚不十分清楚，對(duì)其深入研究、篩選新的診斷標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)，有利于改善肺癌的預(yù)防、診療及預(yù)后。SOX30是SOX基因家族H亞族的唯一成員，在雄性生殖系統(tǒng)中起重要作用[6-7]，本課題組研究發(fā)現(xiàn)SOX30是肺癌的一個(gè)新抑癌基因，它能通過(guò)調(diào)控p53表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，與肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)[8-9]。最近研究還發(fā)現(xiàn)SOX30能夠抑制肺癌的侵襲和遷移，但分子機(jī)制尚不清楚。對(duì)SOX30調(diào)控基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)SOX30與橋粒蛋白基因PKP2表達(dá)顯著相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，PKP2與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和遷移有關(guān)，在口咽腫瘤[10]、膀胱癌[11]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[12]、胃癌[13]、乳腺癌[14]中均有相關(guān)報(bào)道。推測(cè)SOX30與PKP2在肺癌中可能存在表達(dá)調(diào)控關(guān)系，并且通過(guò)PKP2發(fā)揮抑癌作用。因此，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)、SOX30差異表達(dá)細(xì)胞模型和基因敲除動(dòng)物模型，分析SOX30對(duì)PKP2表達(dá)的影響，分析二者在肺癌中的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步研究二者在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制提供資料。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

1.1.1細(xì)胞株 HBE、A549、H460、H520、H358、H1975、SPC-A1、95D及LTEP細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，前期已將H460及H520細(xì)胞轉(zhuǎn)染SOX30表達(dá)載體成功構(gòu)建H460-SOX30及H520-SOX30穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.1.2SOX30基因敲除小鼠SOX30基因敲除小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所構(gòu)建，品系為C57BL6，飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))，由本室繁殖維護(hù)，利用PCR對(duì)新生小鼠基因型進(jìn)行鑒定。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循倫理學(xué)要求。

1.1.3主要試劑及儀器 胎牛血清、胰酶、F-12K及RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司，總RNA提取試劑TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen，GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)及2×GoTaq?qPCR Green Master Mix 購(gòu)自Promega，Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)、PMSF(ST506)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012)、SDS-PAGE配膠試劑盒(P0012A)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，SOX30抗體及PKP2抗體均購(gòu)自Santa Cruz，普通RT-PCR儀、CFX96 qRT-PCR儀、蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories。

1.2 方法

1.2.1臨床標(biāo)本數(shù)據(jù)來(lái)源及熱圖繪制 肺癌中SOX30與PKP2基因的表達(dá)數(shù)據(jù)下載于UCSC Xena(網(wǎng)址：https://xenabrowser.net)，SOX30基因表達(dá)數(shù)據(jù)集及PKP2基因表達(dá)數(shù)據(jù)集ID均為T(mén)CGA.LUNG. sampleMap/HiSeqV2。通過(guò)提取SOX30、PKP2基因表達(dá)信息數(shù)據(jù)并進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)匹配獲得具有SOX30、PKP2基因表達(dá)信息的非小細(xì)胞肺癌與癌旁組織1 129例，肺腺癌與癌旁組織571例，肺鱗癌與癌旁組織553例。肺癌組織與癌旁組織中SOX30與PKP2的表達(dá)熱圖于網(wǎng)站https://genome-cancer.ucsc.edu/proj/site/hgHeatmap/在線繪制。

1.2.2SOX30轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 于網(wǎng)站http://jaspar.binf.ku.dk/在線預(yù)測(cè)PKP2啟動(dòng)子區(qū)SOX30轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) HBE、H460、H520、H358、H1975、SPC-A1、95D及LTEP細(xì)胞株及H460-SOX30、H520-SOX30穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，A549細(xì)胞使用含10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基，所有細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的常規(guī)培養(yǎng)箱中，均采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.4RNA提取及cDNA合成 各細(xì)胞株的RNA提取均采用TRIzol 提取法,測(cè)定RNA濃度和純度后參照GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)說(shuō)明書(shū)合成cDNA。SOX30基因敲除小鼠肺組織進(jìn)行液氮研磨后參照上述方法提取總RNA、合成cDNA。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè) 合成引物：(1)SOX30引物，上游序列AAACCAAAGATGTCCCGCTCAC，下游序列GGTCGCTTCACATGACCATTT；(2)PKP2引物，上游序列GTGGGCAACGGAAATC TTCAC，下游序列CCAGCCTTTAGCATGTCATAGG；(3)β-Actin引物，上游序列:CCACGAAACTACCTTCAACTCC，下游序列GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：上游引物(F)1 μL，下游引物(R)1 μL，2×GoTaq?qPCR GreenMaster Mix 10 μL，cDNA模板200 ng，Nuclease-free water補(bǔ)足至20 μL。β-Actin作為內(nèi)參基因。qRT-PCR程序如下：(1)95 ℃，3 min；(2)95 ℃，15 s；(3)60 ℃，30 s；(4)返回第(2)步，40個(gè)循環(huán)；(5)65.0 ℃逐漸上升到95 ℃，每5 s上升0.5 ℃，結(jié)束。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計(jì)算PKP2在不同細(xì)胞或組織中的相對(duì)表達(dá)量，并使用算得的相對(duì)值在Graphpad prism 6 軟件中繪圖。

1.2.6蛋白提取及Western Blot檢測(cè) H460-SOX30及H520-SOX30穩(wěn)轉(zhuǎn)系細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，配平后按1體積蛋白加1/4體積5×loading buffer(上樣緩沖液)配成混合液,混勻后于100 ℃加熱5 min變性，配制10%的SDS-PAGE膠，每孔總蛋白上樣量為40 μg。80 V恒壓電泳2 h，之后4 ℃冷庫(kù)80 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h，接著3%的BSA室溫封閉1 h，一抗(兔抗SOX30按1:800稀釋、PKP2按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。次日取出，TBST洗膜10 min×3次，然后二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。最后使用VILBER公司的FUSION FX5 specra成像系統(tǒng)，滴加顯影劑進(jìn)行曝光，保存圖片。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，圖片使用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析，以灰度值大小間接反映蛋白含量，并使用Graphpad prism 6 軟件繪圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SOX30與PKP2在肺癌中的關(guān)系

首先利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析了SOX30與PKP2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果表明二者在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)呈正相關(guān)(圖1A)。盡管SOX30基因與PKP2基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)有相關(guān)性，但是相關(guān)系數(shù)較小，為此進(jìn)一步分析了非小細(xì)胞肺癌主要亞型肺腺癌與肺鱗癌中二者的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示二者在肺腺癌中表達(dá)呈正相關(guān)(圖1B)，在肺鱗癌中表達(dá)不相關(guān)(圖1C)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肺癌基因表達(dá)Fig.1 The gene expression heat map of lung cancer from TCGA database

2.2 SOX30基因可能轉(zhuǎn)錄調(diào)控PKP2基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步證實(shí)SOX30蛋白可能調(diào)控PKP2基因的表達(dá)，利用JASPAR 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://jaspar.binf.ku.dk)對(duì)SOX30蛋白在PKP2基因啟動(dòng)子區(qū)的潛在的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PKP2基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)SOX30蛋白轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)(表1)，提示SOX30很可能轉(zhuǎn)錄調(diào)控PKP2的表達(dá)。

表1 PKP2啟動(dòng)子區(qū)SOX30蛋白轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Tab.1 The prediction of SOX30 transcription binding sites in PKP2 promoter region

2.3 PKP2在HBE及8株肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

為了證實(shí)PKP2在HBE及肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，檢測(cè)了這些細(xì)胞株中PKP2 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PKP2在HBE細(xì)胞中有較高表達(dá)，8株肺癌細(xì)胞中PKP2 mRNA水平相對(duì)HBE均呈下調(diào)趨勢(shì)(圖2)，這與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的SOX30基因在肺癌細(xì)胞中總體表達(dá)下降一致[8]。

圖2 各肺癌細(xì)胞株中PKP2 mRNA表達(dá)情況Fig.2 The mRNA expression levels of PKP2 in lung cancer cell lines

2.4 過(guò)表達(dá)SOX30上調(diào)PKP2基因的表達(dá)

為進(jìn)一步確定肺癌中SOX30對(duì)PKP2具有表達(dá)調(diào)控關(guān)系，利用肺癌細(xì)胞株H460和H520構(gòu)建了SOX30高表達(dá)細(xì)胞模型，利用qRT-PCR和Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，在H460細(xì)胞中SOX30高表達(dá)后顯著上調(diào)PKP2的mRNA及蛋白水平(圖3)，而在肺鱗癌細(xì)胞H520中過(guò)表達(dá)SOX30后PKP2的mRNA及蛋白水平未見(jiàn)顯著變化(圖4)，這與SOX30與PKP2在臨床肺鱗癌中表達(dá)不相關(guān)一致。

注：A為PKP2 mRNA表達(dá)水平，B、C、D為SOX30及PKP2蛋白表達(dá)水平，Vector代表空載質(zhì)粒；(1)與Vector比較，P<0.01圖3 H460-SOX30穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中PKP2 mRNA及蛋白表達(dá)水平Fig.3 The levels of mRNA and protein of PKP2 in the H460-SOX30 stably transfected cells

注：A為PKP2 mRNA表達(dá)水平，B、C、D為SOX30及PKP2蛋白表達(dá)水平，Vector代表空載質(zhì)粒；(1)與Vector比較，P<0.001圖4 H520-SOX30穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中PKP2 mRNA及蛋白表達(dá)水平Fig.4 The levels of mRNA and protein of PKP2 in the H520-SOX30 stably transfected cells

2.5 敲除SOX30對(duì)PKP2表達(dá)的影響

為了確定SOX30對(duì)PKP2表達(dá)調(diào)控的重要作用，進(jìn)一步利用SOX30基因敲除動(dòng)物模型，檢測(cè)了小鼠肺組織中PKP2 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純合子(SOX30-/-)小鼠肺組織中PKP2 mRNA表達(dá)水平顯著低于雜合子(SOX30+/-)及野生型(SOX30+/+)小鼠(圖5)，表明SOX30對(duì)PKP2基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。

(1)與SOX30-/-比較，P<0.01圖5 SOX30基因敲除小鼠肺組織中PKP2 mRNA表達(dá)水平Fig.5 The mRNA levels of PKP2 in the lung tissues of the SOX30 gene knockout mice

3 討論

Plakophilins蛋白家族包括Plakophilin 1(PKP1)、Plakophilin 2(PKP2)及Plakophilin 3(PKP3)，是細(xì)胞黏附分子p120ctn家族的成員，分子結(jié)構(gòu)中具有特征性的Armadillo重復(fù)序列(含45個(gè)氨基酸)，且與p120ctn該序列的相似性約為50%。Plakophilins蛋白主要定位于橋粒，對(duì)細(xì)胞橋粒的組成及功能維持有重要作用。研究表明PKP2是唯一在心臟表達(dá)的Plakophilin 蛋白，是心肌細(xì)胞胞間黏附所必需的；PKP2的突變是致心律失常性右室心肌病發(fā)病的主要原因[15-17]。眾多研究也表明PKP2參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Papagerakis等[10-12]研究發(fā)現(xiàn)PKP2在口咽腫瘤轉(zhuǎn)移癌組織、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，與腫瘤的增殖、侵襲、遷移有關(guān)；但在胃癌中PKP2的表達(dá)顯著下調(diào)[13]，而乳腺癌中PKP2的表達(dá)與正常配對(duì)組織相比并無(wú)顯著差異[14]，而且與患者的臨床病理特征也無(wú)相關(guān)性，表明不同類型腫瘤中PKP2的表達(dá)及功能不同。但是，PKP2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制及作用機(jī)制還不清楚。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SOX30與PKP2在肺腺癌中表達(dá)正相關(guān)，在肺鱗癌中表達(dá)不相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究顯示，SOX30是肺腺癌中的一個(gè)典型抑癌基因，其高表達(dá)有利于患者預(yù)后，而在肺鱗癌中并無(wú)顯著的抑癌作用[9]，因此，SOX30與PKP2表達(dá)僅在肺腺癌中相關(guān)與SOX30基因功能一致。隨后發(fā)現(xiàn)在PKP2啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)SOX30蛋白轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，提示SOX30很可能轉(zhuǎn)錄調(diào)控PKP2的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中PKP2 mRNA水平較HBE呈下調(diào)趨勢(shì)，與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SOX30在肺癌細(xì)胞株中普遍低表達(dá)的趨勢(shì)一致，初步確定二者在肺癌中存在表達(dá)相關(guān)性[8]。為證實(shí)二者在肺癌中的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，進(jìn)一步檢測(cè)了H460-SOX30及H520-SOX30穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中PKP2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SOX30將顯著提高H460細(xì)胞中PKP2的表達(dá)水平，但在肺鱗癌細(xì)胞H520中未見(jiàn)明顯變化，這與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致，表明SOX30與PKP2在肺鱗癌中表達(dá)不相關(guān)。更為重要的是，敲除SOX30基因后，小鼠肺組織中PKP2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)一步表明SOX30對(duì)PKP2的表達(dá)有關(guān)鍵調(diào)控作用。

綜上所述，本研究初步表明SOX30是PKP2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵分子，SOX30-PKP2可能在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。后續(xù)需要進(jìn)一步利用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)合肺癌臨床樣本，進(jìn)一步探討二者的調(diào)控關(guān)系和抑癌分子機(jī)制，為深入了解SOX30、PKP2基因的功能提供資料。