宗興風(fēng)，劉栓栓，劉 豪，姚正培，王 波，任燕萍，張 樺,2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 干旱區(qū)荒漠研究所，烏魯木齊 830052)

NAC(NAM， ATAF1/2， CUC2)是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，其名稱(chēng)來(lái)源于第一個(gè)被克隆的矮牽牛的NAM(no apical meristem)以及隨后在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的 ATAF1、 ATAF2和CUC(cup-shaped cotyledon)的首字母縮寫(xiě)[1-3]。目前，已經(jīng)在擬南芥中發(fā)現(xiàn)117個(gè)NAC家族成員，水稻中則發(fā)現(xiàn)151個(gè)，它們均具有一個(gè)高度保守的N端DNA結(jié)合域，以及一個(gè)多樣的C端轉(zhuǎn)錄調(diào)控域[4]。研究發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如促進(jìn)種子萌發(fā)[5]、參與側(cè)根的形成[6-7]、延緩植物葉片衰老[8]以及調(diào)控纖維素合成[9]、次生壁生長(zhǎng)[10-11]等。Ei等[12]從水稻中克隆得到一個(gè)與調(diào)控衰老和抽穗相關(guān)的基因 OsY37 (OryzasativaYellow37, ONAC011) ，并在 OsY37轉(zhuǎn)基因水稻和擬南芥植株中發(fā)現(xiàn) OsY37是水稻生育期抽穗和衰老的正調(diào)控因子。張海娟等[13]發(fā)現(xiàn)蕪菁中 BcNAC2 基因在嫩角果中具有較高的表達(dá)豐度，組織原位雜交顯示在胚囊中 BcNAC2表達(dá)較高，故推測(cè)該NAC 轉(zhuǎn)錄因子可能與種子或胚的形成發(fā)育有關(guān)。同時(shí)，NAC轉(zhuǎn)錄因子還參與植物對(duì)各種非生物與生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程，棉花 GhATAF1基因可同時(shí)響應(yīng)脫落酸(ABA)、低溫、鹽脅迫及黃萎病菌的誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá) GhATAF1不僅可以增強(qiáng)棉花對(duì)鹽脅迫的耐受性還會(huì)增加棉株對(duì)黃萎病菌和灰霉病菌的易感性[14]。大麥NAC轉(zhuǎn)錄因子 HvNAC6可以通過(guò)外源ABA處理增強(qiáng)野生型植株對(duì)于活體營(yíng)養(yǎng)病原體白粉病的抗性[15]。三七(Panaxnotoginseng(Burk)F. H. Chen) 轉(zhuǎn)錄因子 PnNAC1可響應(yīng)茉莉酸甲酯、乙烯利、水楊酸和過(guò)氧化氫幾種逆境相關(guān)信號(hào)分子，并參與三七對(duì)茄腐鐮刀菌和人參鏈格孢的防衛(wèi)反應(yīng)[16]。

梭梭[Haloxylonammodendron(C.A.Mey.)Bunge]是重要的荒漠建群種，在長(zhǎng)期不斷適應(yīng)極端氣候條件的生長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中，產(chǎn)生了極強(qiáng)的抗干旱、抗高溫、抗嚴(yán)寒、耐鹽堿等特性[17]，形成了其獨(dú)特的抗逆分子機(jī)制。因此，研究梭梭NAC轉(zhuǎn)錄因子對(duì)分析梭梭抗逆分子機(jī)制和選育優(yōu)良抗逆材料及荒漠化治理具有重要意義。植物生態(tài)適應(yīng)性分子機(jī)制研究與應(yīng)用前期通過(guò)梭梭干旱脅迫后轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，克隆得到梭梭 HaNAC2基因(登錄號(hào)為KU534094)，其編碼的HaNAC2蛋白定位于細(xì)胞核中，同源分析結(jié)果顯示 HaNAC2屬于XNDⅠ亞組，且 HaNAC2啟動(dòng)子包含多個(gè)與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)與逆境脅迫響應(yīng)元件，說(shuō)明該基因可能受到干旱、溫度和鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo)[18-19]。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，在不同非生物脅迫下分析 HaNAC2基因的表達(dá)模式，并在干旱、高溫和鹽脅迫下對(duì) HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步了解梭梭NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御逆境脅迫中的作用機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)所用的梭梭種子采自于新疆吉木薩爾縣野生梭梭，煙草為普通煙草。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTPs、 10×TaqBuffer、2/15K marker、T4DNA 連接酶、植物基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)于北京全式金生物公司；Trizol試劑購(gòu)于天根生化科技有限公司；SYBR Premix 熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于life公司；NcoⅠ、SpeⅠ限制性?xún)?nèi)切酶及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于天根公司。共生培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+Kan (250 mg/L)+Cef (500 mg/L)；生根培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+Cef (500 mg/L)。

1.1.3 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞、 pEASY-T1 Simple 克隆載體購(gòu)于北京全式金生物公司；農(nóng)桿菌菌株 EHA105和pCAMBIA 1304均為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已知的 HaNAC2基因555 bp的ORF序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)梭梭 HaNAC2熒光定量引物和18S rRNA、 HaACT7內(nèi)參基因[20]引物用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，兩端加有NcoⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物HaNAC2-1304-F/R和潮霉素引物HPT -F/R用于構(gòu)建植物表達(dá)載體與轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性檢測(cè)。引物合成與測(cè)序均由新疆昆泰瑞生物技術(shù)有限公司完成。引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

注:CCATGGNcoⅠ酶切位點(diǎn); ACTAGTSpeⅠ酶切位點(diǎn)。

Note:CCATGGNcoⅠrestriction site; ACTAGTSpeⅠrestriction site.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫處理 模擬地表高溫脅迫：選用正常生長(zhǎng)的1 a生梭梭幼苗與同化枝約10 cm的梭梭幼苗分別進(jìn)行不同處理。對(duì)1 a生梭梭幼苗進(jìn)行模擬地表高溫脅迫，用加熱線(xiàn)在梭梭幼苗接觸土壤處控溫進(jìn)行高溫脅迫，以30 ℃為對(duì)照，分別在40 ℃和55 ℃高溫脅迫24 h后恢復(fù)30 ℃，脅迫 0 h、2 h、12 h、24 h和恢復(fù)30 ℃后第3天、第6 天、第15 天時(shí)取樣；模擬干旱脅迫、高鹽脅迫及植物生長(zhǎng)素(IAA)、脫落酸(ABA)處理：將同化枝約10 cm的梭梭幼苗的根系分別浸沒(méi)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% PEG6000溶液、200 mmol/L NaCl溶液、20 μmol/L IAA溶液及100 μmol/L ABA溶液中， 25 ℃分別處理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h時(shí)取梭梭同化枝。取樣后液氮速凍，-80 ℃保存。

1.2.2 pCAMBIA1304- HaNAC2植物表達(dá)載體構(gòu)建 以 HaNAC2基因的克隆質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)好的帶酶切位點(diǎn)引物 HaNAC2-1304-F/R進(jìn)行PCR，膠回收后與pEASY-T1 Simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，待測(cè)序正確后，擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒。用NcoⅠ和SpeⅠ限制酶分別對(duì)該目的基因質(zhì)粒和pCAMBIA1304載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，切膠回收酶切產(chǎn)物，將 HaNAC2目的片段與pCAMBIA1304載體片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化 DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有Kan抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，經(jīng)菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定后的陽(yáng)性克隆送新疆昆泰瑞公司測(cè)序。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草獲得陽(yáng)性植株 取 EHA105農(nóng)桿菌菌液在含Rif的YEB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)活化，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，用預(yù)冷的CaCl2制備農(nóng)桿菌感受態(tài)。利用熱激法將pCAMBIA1304-HaNAC2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有50 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif的YEB平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)24～36 h。挑取生長(zhǎng)出的單菌落至1 mL含有50 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif的YEB液體培養(yǎng)基，28 ℃震蕩培養(yǎng)后菌液PCR鑒定篩選出陽(yáng)性菌落。

經(jīng)陽(yáng)性鑒定的農(nóng)桿菌進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)的煙草葉片，置于共生培養(yǎng)基上28 ℃避光條件下共培養(yǎng)2 d。之后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，25 ℃光照條件下進(jìn)行篩選培養(yǎng)，待煙草不定芽長(zhǎng)出后，小心切下小芽繼續(xù)放在篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。待不定芽長(zhǎng)到 4 cm以上或5片葉時(shí)，將煙草從篩選培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到煙草生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。當(dāng)轉(zhuǎn)基因煙草幼苗根系長(zhǎng)大健全后，進(jìn)行煉苗移栽。獲得T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株，提取基因組DNA，以HaNAC2-1304-F/R特異性引物和HPT -F/R潮霉素引物進(jìn)行PCR，篩選出T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株的篩選與表達(dá)分析 收獲T1代轉(zhuǎn)基因煙草種子，種植于土中，提取基因組DNA和總RNA，DNA繼續(xù)采用“1.2.3”的方法進(jìn)行PCR鑒定陽(yáng)性植株，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用HaNAC2-F/R和HaACT7-F/R引物進(jìn)行半定量PCR，分析T1代植株中 HaNAC2基因的表達(dá)情況。

1.2.5 脅迫處理后表型觀察 用野生型煙草與“1.2.3”和“1.2.4”中鑒定的 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草植株種子進(jìn)行正常條件下與模擬干旱條件下的發(fā)芽試驗(yàn)，分別將野生型與 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草種子點(diǎn)在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，每個(gè)株系100粒種子。正常條件下發(fā)芽的對(duì)照組用蒸餾水保持培養(yǎng)皿中的濾紙濕潤(rùn)，模擬干旱的處理組每天用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% PEG6000保持培養(yǎng)皿中的濾紙濕潤(rùn)，觀察統(tǒng)計(jì)每天的發(fā)芽率，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

挑選正常生長(zhǎng)至6周齡大小長(zhǎng)勢(shì)均一的野生型和 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草幼苗，進(jìn)行澆足水后不再澆水的自然干旱脅迫，觀察煙草植株和根系表型變化；取相同部位大小均一的野生型和 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草葉片，于48 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫處理，觀察煙草葉片表型變化并統(tǒng)計(jì)葉片失水率情況；將長(zhǎng)勢(shì)均一的野生型和 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草幼苗根系浸于250 mmol/L NaCl溶液中進(jìn)行鹽脅迫處理，觀察脅迫后煙草植株表型變化。

1.2.6 生理指標(biāo)測(cè)定 取野生型和 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草幼苗葉片，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% PEG6000溶液和48 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行模擬干旱與高溫脅迫處理，觀察脅迫后野生型和 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草葉片表型變化。分別在脅迫0 h、6 h、12 h、24 h后取其葉片，以0 h為未脅迫對(duì)照，參考李合生[21]的酸性茚三酮法和蒽酮法測(cè)定脯氨酸和可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 HaNAC2表達(dá) 模式

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析梭梭 HaNAC2基因在模擬地表高溫脅迫、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫、200 mmol/L NaCl高鹽脅迫、20 μmol/L IAA及100 μmol/L ABA處理下的表達(dá)模式。在根中40 ℃的脅迫24 h無(wú)明顯表達(dá)，在恢復(fù) 30 ℃后 HaNAC2的表達(dá)量在第3天開(kāi)始上調(diào)，15 d達(dá)到最大；55 ℃脅迫2 h達(dá)到最大，在恢復(fù)30 ℃第6天到脅迫前水平，根中 HaNAC2對(duì)55 ℃的地表高溫響應(yīng)更迅速(圖1-A)。在同化枝中 40 ℃和55 ℃脅迫后 HaNAC2的表達(dá)量在脅迫后恢復(fù)第3天達(dá)到最大值，之后表達(dá)量下調(diào)又恢復(fù)到脅迫前水平，同化枝中 HaNAC2對(duì)40 ℃的地表高溫響應(yīng)更迅速(圖1-B)。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的增加， HaNAC2在脅迫12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，之后恢復(fù)到脅迫前水平(圖1-C)；在200 mmol/L NaCl溶液的高鹽脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的增加， HaNAC2在脅迫1 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，之后表達(dá)量下調(diào)(圖1-D)；在20 μmol/L IAA溶液處理下，隨著處理時(shí)間的增加， HaNAC2的表達(dá)量在6 h達(dá)到最大，之后恢復(fù)到處理前水平(圖1-E)；在100 μmol/L ABA溶液處理下，隨著處理時(shí)間的增加， HaNAC2在1 h表達(dá)量下調(diào)，之后表達(dá)量上調(diào)，在12 h達(dá)到最大(圖1-F)。結(jié)果表明 HaNAC2基因均能響應(yīng)模擬地表高溫脅迫、模擬干旱脅迫、高鹽脅迫及IAA、ABA處理。

A.模擬地表高溫脅迫(根) Simulated surface heat stress(root); B.模擬地表高溫脅迫(同化枝) Simulated surface heat stress(branch); C.模擬干旱脅迫 Simulated drought stress;D.高鹽脅迫 High salt stress;E.IAA處理 IAA Treatment; F.ABA處理 ABA treatment; *代表差異達(dá)顯著水平(P<0.05) Represents significant difference (P<0.05); **代表差異達(dá)極顯著水平 (P<0.01) Represents extremely significant difference(P<0.01)

圖1 不同脅迫處理下 HaNAC2的表達(dá)模式
Fig.1 Expression pattern of HaNAC2 under different stress treatments

2.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

為了研究梭梭 HaNAC2基因在植物抵御逆境脅迫中的作用，構(gòu)建pCAMBIA1304- HaNAC2植物表達(dá)載體，通過(guò)NcoⅠ和SpeⅠ雙酶切鑒定(圖2)，測(cè)序成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 EHA105農(nóng)桿菌中進(jìn)行驗(yàn)證，葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草葉片。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株篩選與表達(dá)分析

以pCAMBIA1304- HaNAC2重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照(+)，野生型煙草DNA和水做陰性對(duì)照(-)，用特異性引物HaNAC2-1304-F/R(555 bp)和潮霉素引物HPT -F/R(812 bp)對(duì)T0代和T1代 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行陽(yáng)性篩選，結(jié)果顯示T0代煙草中都轉(zhuǎn)入了 HaNAC2基因，T1代煙草中篩選出1、2、5、7陽(yáng)性株系(圖3)。用HaNAC2-F/R和HaACT7-F/R為引物對(duì)4個(gè)T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草中 HaNAC2的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草株系中1、2、5表達(dá)量較高(圖4)。

2.4 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草脅迫后表型分析

取T1代 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)量較高的L1、L2、L5株系的種子與野生型煙草種子，在正常條件下和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% PEG6000模擬干旱脅迫下進(jìn)行萌發(fā)，并統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常條件下 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草較野生型煙草萌發(fā)時(shí)間推遲，且發(fā)芽率低于野生型煙草(圖5-A)，而在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% PEG6000模擬干旱脅迫下 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草萌發(fā)時(shí)間提前，且發(fā)芽率顯著高于野生型煙草(圖5-B)。6周齡的野生型煙草和 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草幼苗在干旱脅迫8 d后野生型煙草比轉(zhuǎn)基因煙草明顯萎蔫(圖5-C)，且 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草相比野生型煙草具有更發(fā)達(dá)的側(cè)根(圖5-D)； 48 ℃高溫培養(yǎng)箱中脅迫處理8 h后，野生型煙草葉片較 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草葉片明顯萎蔫(圖5-E)，且隨著高溫脅迫時(shí)間的增加野生型煙草葉片的失水率顯著高于 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草葉片(圖5-G)；250 mmol/L NaCl溶液中鹽脅迫處理8 h后，野生型煙草植株明顯萎蔫，而 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草萎蔫程度較輕(圖5-F)。綜上所述， HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草在干旱、高溫、鹽脅迫下的表型變化都明顯優(yōu)于野生型煙草，表明 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草 比野生型煙草具有更強(qiáng)的抗旱性、耐熱性與耐 鹽性。

M1.2K Marker; M2.15K Marker; 1.pCAMBIA1304- HaNAC2重組質(zhì)粒 pCAMBIA1304- HaNAC2 recombinant plasmid

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

A. HaNAC2-1304-F/R引物 HaNAC2-1304-F/R primer; B.HPT -F/R引物 HPT -F/R primer; M.2K Marker 2K Marker; +.陽(yáng)性對(duì)照 Positive control; - .陰性對(duì)照 Negative control; 1～7. HaNAC2轉(zhuǎn)基因植株 HaNAC2 transgenic plants

圖3 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性篩選
Fig.3 Positive screening of HaNAC2transgenic tobacco

1、2、5、7編號(hào)同圖3 Numbers 1,2,5 and 7 are the same as Fig.3

圖4 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草半定量PCR分析
Fig.4 RT-PCR analysis of HaNAC2transgenic tobacco

2.5 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草脅迫后生理指標(biāo)分析

在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% PEG6000模擬干旱脅迫下和48 ℃高溫脅迫下測(cè)定各株系煙草的生理指標(biāo)，結(jié)果顯示 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草中脯氨酸和可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高且上升幅度明顯高于野生型煙草(圖6)。脯氨酸和可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與植物對(duì)逆境脅迫的抵抗能力正相關(guān)，說(shuō)明梭梭 HaNAC2基因提高了煙草的抗旱性與耐熱性。

A.正常條件下的發(fā)芽率 Germination rate under normal condition; B.模擬干旱條件下的發(fā)芽率 Germination rate under simulated drought conditions; C.干旱脅迫下植株表型變化 Phenotypic changes of plants under drought stress; D.干旱脅迫后根系生長(zhǎng)情況 Root growth after drought stress; E.高溫脅迫下葉片表型變化 Phenotypic changes of leaves under high temperature stress; F.高鹽脅迫下植株表型變化 Phenotypic changes of plants under high salt stress; G.高溫脅迫下葉片失水率 Leaf water loss rate under high temperature stress

圖5 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草表型鑒定
Fig.5 Phenotypic identification of HaNAC2transgenic tobacco

3 討論與結(jié)論

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程，植物遇逆境脅迫時(shí)會(huì)從分子、細(xì)胞、生理和生化水平上做出適應(yīng)性調(diào)整，以抵御和適應(yīng)外部環(huán)境因子的脅迫，因此形成了高效的脅迫應(yīng)答機(jī)制，此過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[22]。非生物脅迫往往會(huì)引起植物體內(nèi)生理指標(biāo)的變化，如脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)都可以作為衡量植物抗逆性的生理指標(biāo)。脯氨酸和可溶性糖為小分子的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在維持植物體內(nèi)水分平衡方面起到重要作用，植物在正常生長(zhǎng)時(shí)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，當(dāng)干旱、高溫脅迫時(shí)植物中的脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)則顯著增加[23]，脯氨酸有保護(hù)脅迫下細(xì)胞內(nèi)大分子穩(wěn)定性的作用[24]；趙江濤等[25]在研究可溶性糖的生理作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，其參與干旱脅迫時(shí)的滲透調(diào)節(jié)過(guò)程、復(fù)水后的生理恢復(fù)和修復(fù)過(guò)程；脯氨酸和可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與植物對(duì)逆境脅迫的抵抗能力正相關(guān)。

作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，NAC家族中的大多數(shù)成員都是誘導(dǎo)型表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，植物不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、病原體侵染、高鹽、干旱、低溫、植物激素刺激和機(jī)械損傷等生物與非生物脅迫都可誘導(dǎo)其表達(dá)[26]。甘藍(lán)中 BoNAC019可能通過(guò)誘導(dǎo)ABA分解代謝基因和降低ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)而參與調(diào)控植物的抗旱性， BoNAC019基因可響應(yīng)干旱、鹽、ABA及H2O2等非生物脅迫處理[27]。鷹嘴豆 CarNAC4受干旱、高鹽、高溫、低溫及ABA、IAA、MeJa和H2O2的誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)表達(dá) CarNAC4的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株抗旱性與耐鹽性得以提高[28]。研究發(fā)現(xiàn)一些梭梭HaNACs在模擬干旱及鹽脅迫下具有多樣的表達(dá)模式，它們可能參與鹽和干旱脅迫應(yīng)答、調(diào)節(jié)過(guò)程，其中 HaNAC1的過(guò)表達(dá)使轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗旱性與耐鹽性提高，HaNAC1可能是通過(guò)調(diào)節(jié)一些與脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控激素表達(dá)水平變化從而提高馬鈴薯的抗旱性[29-31]。本研究分析發(fā)現(xiàn)在模擬地表高溫、模擬干旱、高鹽及IAA和ABA脅迫處理下 HaNAC2基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，且過(guò)表達(dá)梭梭 HaNAC2的轉(zhuǎn)基因煙草在干旱和高溫、高鹽脅迫下具有更強(qiáng)的抗旱、耐熱與耐鹽的表型，在受到干旱、高溫逆境脅迫后， HaNAC2基因過(guò)表達(dá)煙草葉片中積累了大量的脯氨酸和可溶性糖，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于野生型煙草，表明 HaNAC2的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，使植株維持較為穩(wěn)定的滲透勢(shì)，從而抵御干旱和高溫脅迫的損傷。同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn) HaNAC2基因煙草有更發(fā)達(dá)的根系，推測(cè) HaNAC2基因可能與側(cè)根發(fā)育有關(guān)。由于一個(gè)特定的NAC轉(zhuǎn)錄因子往往同時(shí)涉及多個(gè)發(fā)育或應(yīng)對(duì)多個(gè)逆境因子脅迫過(guò)程[32]，預(yù)示著 HaNAC2可能參與多種信號(hào)傳遞，并與側(cè)根發(fā)育和干旱、高溫及鹽逆境響應(yīng)有關(guān)。

A.干旱脅迫下脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) Proline mass fraction under drought stress; B.高溫脅迫下脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) Proline mass fraction under high temperature stress; C.干旱脅迫下可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) Soluble sugar mass fraction under drought stress; D.高溫脅迫下可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) Soluble sugar mass fraction under high temperature stress

圖6 HaNAC2轉(zhuǎn)基因煙草生理生化指標(biāo)
Fig.6 Physiological and biochemical indexes of HaNAC2 transgenic tobacco