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        血清miR-133a 、miR-150在心房顫動(dòng)患者中的表達(dá)水平及臨床意義

        2019-07-18 07:34:44孫杰佟子川郭麗敏唐學(xué)弘
        關(guān)鍵詞:內(nèi)徑心房房顫

        孫杰,佟子川,郭麗敏,唐學(xué)弘

        心房顫動(dòng)(AF,房顫),是臨床中常見(jiàn)的 心律失常。房顫發(fā)生時(shí),心房收縮和舒張能力異常,導(dǎo)致心臟泵血功能受損,血流瘀滯,易形成血栓栓塞、心力衰竭等并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅患者健康[1,2]。由于我國(guó)人口老齡化的加劇,房顫患者人數(shù)不斷上升。目前,房顫的療效并不理想,預(yù)防和治療房顫一直是心血管疾病研究的熱點(diǎn)。microRNAs(miRNAs)是一類高度保守的非編碼小分子RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程。多種miRNA通過(guò)參與心肌電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)在房顫的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。Soeki等[3]研究發(fā)現(xiàn)房產(chǎn)患者血清miR-328水平升高,其與與左心房電壓區(qū)指數(shù)呈正相關(guān),左心房局部產(chǎn)生miR-328可能參與房顫患者的心房重構(gòu)過(guò)程。李菲等[4]研究發(fā)現(xiàn),房顫患者血清miR-101表達(dá)下調(diào),其可能通過(guò)上調(diào)L型鈣通道β2和鈉鈣交換體(NCX)誘發(fā)或促進(jìn)房顫發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),miR-133a在心肌中特異性表達(dá),參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞分化、增殖[5]。miR-150表達(dá)與心肌重構(gòu)、心肌纖維化等密切相關(guān)[6]。本研究通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)房顫患者血清miR-133a和miR-150表達(dá)水平,分析其臨床意義,為房顫的臨床診斷標(biāo)記物的選擇和該疾病的治療尋找新的突破口。

        1 資料與方法

        1.1 研究對(duì)象選擇2015年1月至2016年12月于首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的73例房顫患者為研究對(duì)象,其中男性41例,女性32例,年齡39~86歲,平均年齡(59.43±8.71)。依據(jù)2014年《美國(guó)心房顫動(dòng)治療指南》將73例房顫患者分為陣發(fā)性房顫21例、持續(xù)性房顫28例、永久性房顫24例。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并惡性腫瘤患者;②合并自身免疫疾病患者;③合并腎功能不全患者;④臨床資料完整者。另選取25例健康志愿者為對(duì)照組,其中男性14例,女性11例,年齡35~85歲,平均年齡(58.27±8.69)歲。所有受試者均自愿簽署知情同意書(shū)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器RNA提取試劑盒,美國(guó)Invitrogen公司;熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒,日本Takara公司;引物由金斯瑞生物科技公司設(shè)計(jì)提供。AU5800全自動(dòng)生化分析儀,貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司;Nano-400超微量核酸儀,杭州奧盛儀器有限公司;LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

        1.3 血樣采集采集所有受試者清晨空腹靜脈血,置于抗凝管中,4℃、3500 r/min離心10 min,收集上清液-20℃保存?zhèn)溆?。?jīng)心臟彩超檢查獲取受試者左心房?jī)?nèi)徑(LAD)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

        1.4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。試劑盒檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)。

        1.5 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)血清miR-133a和miR-150水平采用試劑盒提取血清中總RNA,微量核酸儀檢測(cè)RNA濃度和純度。在260nm和280nm處吸光值的比值大于1.8時(shí)可用于擴(kuò)增。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明,將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參U6上游引物5'-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGC-3',下游引物5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCT-3';miR-133a上游引物5'-CAAGCTGGTAAAAATGGA

        A-3';下游引物5'-TATGGTTTTGACGACTGT GTAT-3'。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸30 s,總共進(jìn)行45個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。以U6作為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算miR-133a和miR-150的相對(duì)表達(dá)水平。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用n(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 一般資料比較對(duì)照組和房顫患者在年齡、性別、吸煙史、飲酒史、TC、TG、HDL-C、收縮壓、舒張壓比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組比,房顫患者LDL-C、hs-CRP、左心房?jī)?nèi)徑和MMP-9水平顯著升高(P<0.05),LVEF水平顯著降低(P<0.05)。不同類型房顫患者之間比較,LDL-C、hs-CRP、LAD、LVEF、MMP-9差異也顯著(P<0.05)(表1~2)。

        2.2 對(duì)照組和房顫患者血清miR-133a和miR-150比較與對(duì)照組比,房顫患者血清miR-133a水平顯著升高(P<0.05),miR-150水平顯著降低(P<0.05)(表3)。

        表1 對(duì)照組和房顫患者一般資料比較

        表2 不同類型房顫患者一般資料比較

        2.3 不同類型房顫患者血清miR-133a和miR-150比較陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫和永久性房顫三組miR-133a水平依次升高,miR-150水平依次降低。三組間miR-133a和miR-150兩兩比較,差異均顯著(P<0.05)(表4)。

        2.4 房顫患者血清miR-133a和miR-150與各檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,房顫患者血清miR-133a與hs-CRP、左心房?jī)?nèi)徑、MMP-9呈正相關(guān)(P<0.05),與LVEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);miR-150與hs-CRP、左心房?jī)?nèi)徑、MMP-9呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與LVEF呈正相關(guān)(P<0.05)(表5)。

        2.5 miR-133a和miR-150診斷價(jià)值miR-133a、miR-150單獨(dú)診斷以及二者聯(lián)合診斷靈敏度分別為78.1%、83.6%、90.4%,特異度分別為68.0%、68.0%、84.0%、,ROC曲線下面積(AUC)分別為0.693、0.705、0.812。與miR-133a、miR-150單獨(dú)診斷相比,二者聯(lián)合診斷的靈敏度、特異度以及AUC均顯著提高(P<0.05),結(jié)果如圖1所示。

        表3 對(duì)照組和房顫患者血清miR-133a和miR-150表達(dá)水平比較

        表4 不同類型房顫患者血清miR-133a和miR-150比較

        表5 房顫患者血清miR-133a和miR-150與各檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性

        圖1 miR-133a、miR-150以及二者聯(lián)合診斷的ROC曲線

        2.6 logistic回歸分析Logistic回歸分析結(jié)果顯示,與hs-CRP、左心房?jī)?nèi)徑、LVEF和MMP-9類似,miR-133a和miR-150也是影響房顫的因素(P<0.05),結(jié)果如表6所示。

        表6 logistic回歸分析

        3 討論

        房顫是一種多因素誘導(dǎo)、多機(jī)制參與的心律失常。隨著人口老齡化加劇,房顫的發(fā)病率不斷增加,80歲以上人群患病率超過(guò)8%[7]。房顫患者存在心力衰竭、腦卒中等嚴(yán)重的心血管疾病并發(fā)癥,一直以來(lái)都是研究的重點(diǎn)。目前,在心律失常尤其是房顫的診斷方面,缺少有效的診斷指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)或診斷其發(fā)生情況。本研究通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)房顫患者血清miR-133a和miR-150表達(dá)水平并分析其臨床意義,以期為房顫的臨床診斷探尋新的方法或分子標(biāo)記物。

        隨著對(duì)miRNAs研究的的深入,發(fā)現(xiàn)miRNAs參與心力衰竭、心律失常、冠心病等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展,可通過(guò)調(diào)控不同靶基因在房顫的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。miR-133a是肌肉特異性miRNA,在心肌中特異性表達(dá),參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖和分化,可以通過(guò)抑制心肌縫隙連接蛋白和離子通道蛋白的表達(dá)參與心律失常的發(fā)生。徐振宇等[9]研究發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭(CHF)患者血清miR-133a表達(dá)水平顯著升高,其表達(dá)水平與LVEF呈負(fù)相關(guān),與左心房?jī)?nèi)徑呈正相關(guān),檢測(cè)CHF患者血清miR-133a變化有助于判斷患者心室重構(gòu)情況。miR-150定位于人19號(hào)染色體,主要表達(dá)于心肌組織、淋巴結(jié)和脾臟等組織或器官。研究發(fā)現(xiàn),miR-150參與組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展。心肌纖維化能夠造成心機(jī)結(jié)構(gòu)重構(gòu),進(jìn)而導(dǎo)致房顫的發(fā)生。周小翠等[10]研究發(fā)現(xiàn),心肌梗死邊緣區(qū)miR-150表達(dá)水平顯著下降,上調(diào)其表達(dá)可通過(guò)作用靶基因c-Myb改善心肌纖維化。李冰等[11]研究發(fā)現(xiàn),房顫患者射頻消融術(shù)前血漿miR-150水平較健康體檢者顯著降低,術(shù)后miR-150水平較術(shù)前顯著升高,miR-150可能與房顫的發(fā)病機(jī)制相關(guān),并能調(diào)控疾病的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比,房顫患者血清miR-133a水平顯著升高,miR-150水平顯著降低。除此之外,不同類型的房顫患者血清miR-133a和miR-150比較差異也顯著,提示miR-133a和miR-150均參與房顫的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。 血清作為生物檢測(cè)的樣本,具有取材方便、無(wú)創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn),因此,血清miRNA可作為診斷房顫或其他疾病發(fā)生的生物標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示,miR-133a、miR-150單獨(dú)診斷房顫發(fā)生具有一定的靈敏度和特異度,二者聯(lián)合診斷時(shí)靈敏度和特異度顯著提高,AUC增加,提示miR-133a和miR-150聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于房顫的診斷具有較大的參考價(jià)值。

        心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)在房顫發(fā)生和維持過(guò)程中起重要作用。心房間質(zhì)纖維化會(huì)導(dǎo)致心肌壁變薄、心房擴(kuò)張、心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)等[12]。房顫患者心房明顯纖維化,且隨著纖維化程度越嚴(yán)重,房顫發(fā)生的可能性也越大。研究發(fā)現(xiàn),MMP-9參與心肌纖維化,影響心肌結(jié)構(gòu)重置[13]。本研究結(jié)果顯示,房顫患者M(jìn)MP-9水平較對(duì)照組顯著升高,且不同類型房顫患者M(jìn)MP-9水平比較差異顯著,與相關(guān)研究報(bào)道一致[13,14]。房顫患者血清miR-133a與MMP-9呈正相關(guān),miR-133a過(guò)表達(dá)可能通過(guò)抑制胰島素1號(hào)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)MMP-9表達(dá)上調(diào),參與房顫患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和膠原代謝。超敏C-反應(yīng)蛋白(hsCRP)與心血管疾病關(guān)系密切,hsCRP在房顫炎性標(biāo)志物的臨床應(yīng)用中最為廣泛。李硯杰等[15]研究發(fā)現(xiàn),房顫患者h(yuǎn)sCRP較對(duì)照組顯著增加,且陣發(fā)性、持續(xù)性、永久性房顫患者之間比較差異顯著,與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示,房顫患者血清miR-133a與hs-CRP呈正相關(guān),miR-150與hs-CRP呈負(fù)相關(guān),提示miR-133a和miR-150也可作為血清標(biāo)志物用于判斷房顫患者嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)。房顫過(guò)程與心房結(jié)構(gòu)改變相關(guān),研究證實(shí),房顫患者心房直徑增加。本研究結(jié)果顯示,房顫患者左心房?jī)?nèi)徑較對(duì)照組增加,且不同類型患者之間比較差異顯著,與報(bào)道結(jié)果一致[16]。房顫患者血清miR-133a與左心房?jī)?nèi)徑呈正相關(guān),miR-150與左心房?jī)?nèi)徑呈負(fù)相關(guān),提示miR-133a和miR-150可能通過(guò)影響基質(zhì)金屬蛋白酶活性、間質(zhì)纖維化等進(jìn)而增加心房直徑。

        綜上所述,房顫患者血清miR-133a和miR-150均表達(dá)異常,參與房顫發(fā)生、發(fā)展。聯(lián)合檢測(cè)血清miR-133a和miR-150有望作為房顫患者發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的生物學(xué)標(biāo)志物,通過(guò)深入研究miR-133a和miR-150在該疾病中的作用機(jī)制,可為房顫治療提供新的藥物作用靶點(diǎn)。

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