祁麟，齊春勝，肖波

失巢凋亡（anoikis）是細胞脫離基質或失去與其他細胞接觸時啟動的一種程序化細胞死亡形式，對于機體的正常發(fā)育至關重要[1-2]。但在腫瘤患者體內，部分腫瘤細胞獲得了抵抗失巢凋亡的特性，能夠從腫瘤原發(fā)灶部位脫離出來而不凋亡，從而進入循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生轉移[3]。神經營養(yǎng)因子酪氨酸激酶受體B（TrkB）是近年來新發(fā)現的一種特異性的失巢凋亡抑制因子[4]。大量研究顯示，TrkB 在乳腺癌[5-7]、肝癌[8]、宮頸癌[9-10]、肺癌[11-12]、腦瘤[13]等多種腫瘤細胞中的表達顯著上升，可導致腫瘤細胞獲得失巢凋亡抵抗的特性，表現出較強的轉移能力。目前，靶向肝、肺等器官的遠端轉移是結腸癌患者的主要致死因素之一，但TrkB在結腸癌細胞中的功能尚少見報道。本研究通過構建TrkB-shRNA 慢病毒干擾載體，在具有高轉移潛能的結腸癌細胞SW620中靶向沉默TrkB基因的表達，探討TrkB基因對結腸癌細胞失巢凋亡的影響以及對結腸癌細胞體內轉移的作用機制，為進一步研究TrkB 為靶點的腫瘤治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人結腸癌細胞SW620 和人胚腎上皮細胞HEK-293T 細胞株、質粒pSuper-retro-puro（pSRP）和慢病毒包裝系統(tǒng)（277、pMD2.G、pMDLg/pRR和pRSV-Rev）為本實驗室保存。限制性內切酶等購自NEB 公司，LipofectamineTM2000 轉染試劑盒、TRIzol 試劑、RNA 逆轉錄試劑盒和實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）所用的SYBR?Green kit 購自 Invitrogen 公司，RPMI 1640、DMEM 和胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司，細胞凋亡酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自Roche 公司，兔抗人TrkB 和小鼠抗人β-actin 等抗體購自Santa Cruze 公 司 ，Chemiluminescent HRP substrate 購 自MILLIPORE公司，引物合成和DNA測序由金唯智公司完成，實時定量PCR 儀器為ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 pSRP-iTrkB質粒的構建及鑒定 參考 Douma 等[4]方法設計針對人TrkB基因的shRNA 單鏈寡核苷酸片段，序列見表1。37 ℃退火1 h，連接到用BglⅡ和HindⅢ酶切過的pSRP 載體上，轉化E.coliDH5α 感受態(tài)細胞獲得重組質粒。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切pSRP-iTrkB轉化子質粒和pSRP空載體，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定其是否含有插入片段，將陽性克隆送交華大基因公司通過DNA測序以驗證其正確性。

1.2.2 277-iTrkB質粒的構建及鑒定 277-iTrkB質粒的構建按照本實驗室已有方法[14]進行。用EcoRⅠ酶切pSRP-iTrkB質粒，T4 DNA聚合酶補平缺口，再次用XhoⅠ酶切線性化的質粒，得到含有H1啟動子和shRNA發(fā)夾結構的DNA片段（約320 bp），切膠回收后將其連接到用EcoRⅤ和XhoⅠ酶切過的277 載體，轉化E.coliDH5α 感受態(tài)細胞，獲得重組質粒。用BamHⅠ和XhoⅠ酶切277-iTrkB轉化子質粒和277空載體，并將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

Tab.1 The primer sequence used in this study表1 實驗所用引物序列

1.2.3TrkB-shRNA慢病毒的包裝與感染SW620細胞 按照LipofectamineTM2000試劑盒的操作步驟，將277-iTrkB或陰性對照277-iLuc質粒中加入3種慢病毒包裝輔助質粒pMD2.G、pMDLg/pRR 和 pRSV-Rev 進行 HEK-293T 細胞轉染，獲得含有TrkB-shRNA或陰性對照iLuc-shRNA慢病毒的培養(yǎng)液，將其感染SW620 細胞，構建穩(wěn)定感染細胞系。具體步驟：用上述慢病毒培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞12 h，更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，如此反復3次。用熒光顯微鏡觀察并統(tǒng)計隨機視野1×103個細胞中GFP 陽性細胞比例以確定感染效果，感染效率=GFP陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4 實時定量PCR 檢測TrkB基因在mRNA 水平的沉默效果 常規(guī)培養(yǎng)SW620-iTrkB和SW620-iLuc細胞，采用TRIzol法提取總mRNA，一步法逆轉錄試劑盒獲得cDNA，實時定量PCR檢測各樣本中目的基因TrkB和內參基因GAPDH的表達量。反應體系按照SYBR?Green kit 說明書配置，反應程序：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進行相對定量，計算TrkB基因的相對表達量和沉默效率，實驗重復3次。

1.2.5 Western blot 法檢測TrkB 蛋白的表達 培養(yǎng)SW620-iLuc和 SW620-iTrkB細胞，提取總蛋白，采用 Western blot 法檢測TrkB基因在蛋白質水平的沉默效果。將等量兩份的蛋白樣品用10%分離膠進行SDS-PAGE電泳后，均用濕法將蛋白轉移至PVDF 膜，5%牛奶封閉1 h，TBST 洗膜后分別用兔抗TrkB 多克隆抗體（sc-8316，5%脫脂牛奶1∶1 000 稀釋）和小鼠抗β-actin 單克隆抗體（sc-47778，5%脫脂牛奶1∶5 000稀釋）孵育過夜，經TBST洗膜后分別使用羊抗兔IgG-HRP二抗（sc-2004，5%脫脂牛奶1∶10 000稀釋）和羊抗鼠IgG-HRP（sc-2005，5%脫脂牛奶1∶10 000稀釋）孵育2 h，再次TBST洗膜后用Chemiluminescent HRP substrate 作用在PVDF 膜上3 min，在暗室中曝光于X 射線膠片上。實驗重復3 次，實驗結果采用Image J軟件與SPSS 17.0軟件進行分析。

1.2.6 ELISA 檢測SW620-iTrkB細胞的失巢凋亡水平 用6 g/L poly-HEMA 包被 6 孔板，將 SW620-iLuc和 SW620-iTrkB細胞分別均接種于普通6 孔板和poly-HEMA 包被6 孔板中，培養(yǎng)16 h 后，細胞計數板計數，再使用細胞凋亡ELISA 檢測試劑盒分別檢測貼壁和懸浮2 種生長狀態(tài)下SW620-iLuc和SW620-iTrkB細胞的 405 nm 和 490 nm 波長光密度（optical density，OD），細胞凋亡率表示為OD差值：OD405-OD490。接種于普通6 孔板中的細胞處于貼壁生長狀態(tài)，而接種于poly-HEMA 包被6 孔板中的細胞處于懸浮狀態(tài)，細胞在貼壁生長狀態(tài)和懸浮狀態(tài)的凋亡水平的差異體現了細胞的失巢凋亡水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，2 組間比較用獨立樣本t檢驗，析因設計資料采用兩因素兩水平析因設計方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 pSRP-iTrkB質粒及測序結果 酶切pSRP-iTrkB轉化子質粒，得到了 320 bp 的 DNA 條帶，而酶切空載體得到250 bp的DNA條帶，說明pSRP-iTrkB轉化子質粒含有DNA 插入片段，見圖1。該重組質粒送交華大基因公司進行DNA測序結果顯示，插入片段序列與設計的shRNA 寡核苷酸序列完全一致，說明pSRP-iTrkB質粒構建正確。

Fig.1 Identification of pSRP-iTrkB plasmid by enzyme digestion圖1 pSRP-iTrkB質粒的酶切鑒定

2.2 277-iTrkB質粒構建結果 酶切277-iTrkB轉化子質粒，得到了850 bp的DNA條帶，而酶切277空載體得到530 bp 的DNA 條帶，見圖2。證實277-iTrkB重組質粒構建成功。

2.3TrkB-shRNA 慢病毒的包裝與SW620 細胞感染 慢病毒培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞后，在熒光顯微鏡下可見大多數細胞為GFP 表達陽性，見圖3。感染效率達85%以上，說明慢病毒TrkB-shRNA 成功感染SW620細胞并穩(wěn)定表達。

2.4 SW620-iTrkB細胞中 TrkB 的 mRNA 和 蛋 白 表達水平變化 與SW620-iLuc組相比，SW620-iTrkB組細胞中TrkB 的mRNA 和蛋白相對表達水平均降低（P＜0.05），見表2、圖4。

Fig.2 Restriction enzyme digestion of 277-iTrkB plasmid圖2 277-iTrkB質粒的酶切鑒定

Fig.3 Fluorescence observation of SW620 cells infected by TrkB-shRNA lentivirus(×20)圖3 TrkB-shRNA慢病毒感染SW620細胞的熒光觀察（×20）

Tab.2 Changes of expression level of TrkB mRNA in SW620 cells表2 SW620細胞中TrkB表達水平的變化 （n=3，±s）

Tab.2 Changes of expression level of TrkB mRNA in SW620 cells表2 SW620細胞中TrkB表達水平的變化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別SW620-iLuc組SW620-iTrkB組t TrkB mR NA 1.000±0.000 0.122±0.020 74.313＊＊TrkB 蛋白1.000±0.000 0.066±0.010 159.415＊＊

Fig.4 Western blot detection of TrkB protein level圖4 Western blot法檢測TrkB蛋白表達

2.5 貼壁組和懸浮組SW620-iTrkB細胞的失巢凋亡水平 不同生長狀態(tài)和不同轉染質粒轉染均對SW620-iTrkB細胞的失巢凋亡水平均有影響，存在交互效應（P＜0.05）。各單獨效應下，與貼壁狀態(tài)相比，懸浮狀態(tài)下SW620-iLuc組和SW620-iTrkB組細胞凋亡率均明顯上升（P＜0.05）；在懸浮狀態(tài)下，SW620-iTrkB組細胞凋亡率明顯高于SW620-iLuc組（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Cell Death ELISA detection of cell anoikis levels表3 Cell Death ELISA檢測細胞失巢凋亡水平（n=3，±s）

Tab.3 Cell Death ELISA detection of cell anoikis levels表3 Cell Death ELISA檢測細胞失巢凋亡水平（n=3，±s）

＊P＜0.05；A：不同生長狀態(tài)；B：質粒轉染

生長狀態(tài)貼壁懸浮組別SW620-iLuc組SW620-iTrkB組SW620-iLuc組SW620-iTrkB組FA×B FAFB細胞計數（個）83.758±1.196 74.942±5.343 41.975±7.475 42.933±13.994 57.991＊0.658 1.018細胞凋亡率0.376±0.100 0.412±0.109 1.207±0.228 2.173±0.159 203.421＊30.421＊26.188＊

3 討論

正常的上皮或內皮細胞具有黏附依賴性，這些細胞從原位脫落后會引發(fā)細胞的程序化死亡過程即失巢凋亡[2，15]。近年來，人們越來越多地認識到抑制腫瘤細胞的失巢凋亡抵抗特性是抑制腫瘤轉移的一種有效手段[16]。TrkB 是神經營養(yǎng)酪氨酸激酶受體（neurotrophic tyrosine kinase receptor，NTKR）的家族成員之一，其配體是腦源性神經營養(yǎng)因子（brainderivedneurotrophic factor，BDNF）[17]。近年來的大量研究表明，TrkB 是一個強力的失巢凋亡抑制因子，利用藥物或RNA 干擾技術在腫瘤細胞中失活TrkB是抑制腫瘤轉移的有效手段[3，8，18-19]。

研究認為，在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤細胞中，靶向沉默TrkB基因的表達能夠有效恢復腫瘤細胞對失巢凋亡的敏感性，但在高轉移能力的結直腸癌細胞中的相關研究少見[3，19]。本研究成功構建了特異性靶向沉默TrkB基因的shRNA 表達載體并包裝產生TrkB-shRNA 慢病毒，將其感染到惡性程度較高的人結腸癌細胞SW620中，檢測發(fā)現該慢病毒能夠在mRNA 和蛋白水平顯著下調，表明其抑制了TrkB基因的表達，ELISA實驗檢測發(fā)現SW620細胞下調TrkB基因的表達能夠顯著降低細胞的抗失巢凋亡能力，考慮可能是由于細胞脫離基質后啟動的失巢凋亡途徑造成，且不同生長狀態(tài)和不同轉染質粒轉染均對SW620-iTrkB細胞的失巢凋亡水平有影響，存在交互效應，表明SW620 細胞下調TrkB基因的表達能夠使腫瘤細胞對失巢凋亡的敏感性顯著增加，懸浮狀態(tài)下其影響更大。

綜上，本研究構建的慢病毒干擾載體可以對結腸癌細胞SW620中的TrkB基因產生長期、高效且穩(wěn)定的下調效果；另外，在結腸癌細胞SW620 中下調TrkB 的表達能有效抑制腫瘤細胞的失巢凋亡抗性，從而可能有效抑制結腸癌細胞的轉移，這為結腸癌的治療提供了一種新的思路。