周佰慧，王珍婷，宋霞宇，韓德權(quán)

（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院·黑龍江省高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·教育部農(nóng)業(yè)微生物工程中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

目前，便秘的主要治療方法為藥物治療[1]，常見的潤(rùn)滑性瀉藥包括液體石蠟、開塞露等長(zhǎng)期使用會(huì)干擾維生素的吸收，患者使用更痛苦[2]；刺激性瀉藥，如番瀉葉和大黃等，起效快，但長(zhǎng)期使用會(huì)削弱結(jié)腸動(dòng)力[3]，易引起依賴性和繼發(fā)性便秘[4]。便秘的發(fā)生與腸道微生物菌群失衡[5]，微生態(tài)制劑治療已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[6]。雙歧桿菌在維持腸道菌群平衡中扮演重要的角色，且已被證實(shí)可調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡[7-8]、提高免疫力[9]及改善便秘等[10]。目前，常見的雙歧桿菌制劑主要是硬膠囊、片劑等，難以確保藥物在儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性，且由于其不耐胃酸和膽鹽，難以確保在到達(dá)腸后仍存在大量活菌[11]。因此，本研究中開發(fā)了一種具有結(jié)腸溶性的青春雙歧桿菌軟膠囊，是以大豆油為載體[12]，將HD青春雙歧桿菌混懸其中，制成軟膠囊并對(duì)其膠囊殼進(jìn)行處理使其具有一定的結(jié)腸溶性[13]。本研究中從腸道菌群、排便功能和生理體征3個(gè)方面探討了HD雙歧桿菌結(jié)腸溶性軟膠囊對(duì)便秘家兔緩解便秘的影響，旨在為其臨床應(yīng)用提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[14]?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：PurifiationEquipment潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；3.5L厭氧產(chǎn)氣包（海博生物技術(shù)有限公司）；DHG-914型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；H-1650型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀有限公司）；MVS-1型漩渦混合器（北京金北德工貿(mào)有限公司）；BCD-118TMPA型冰箱（海爾集團(tuán)）；LDZM-75型立式蒸汽壓力滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；ME203E型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；ZB-1E型智能崩解儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

試藥：鹽酸洛哌丁胺（西安楊森制藥有限公司，批號(hào)為20150917）；HD結(jié)腸溶性雙歧桿菌軟膠囊（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)院204實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)為20151013，規(guī)格為0.1 g含1×108cfu）；雙歧桿菌活菌膠囊（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，批號(hào)為 20150607，規(guī)格為 0.35g含 1 ×108cfu）。

動(dòng)物：雄性健康家兔，SPF級(jí)，體質(zhì)量1500～2000 g。飼養(yǎng)條件為室內(nèi)溫度（23±1）℃，相對(duì)濕度40% ～55%。在每天12 h光照和12 h黑暗處理后，在喂食兔配方飼料后7 d開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 結(jié)腸溶性軟膠囊制備（甲醛浸漬法）

體外崩解時(shí)間確定：將軟膠囊浸入錐形瓶中，甲醛體積分?jǐn)?shù)分別為5%，8%，10%，12%，14%，浸漬時(shí)間分別為0.5，1.0，2.0 h。取出浸泡過(guò)的軟膠囊，用無(wú)水乙醇洗滌多次，直至甲醛氣味消失。

結(jié)果見圖 1。在不同體積分?jǐn)?shù)的甲醛溶液中浸泡0.5 h，后崩解時(shí)間小于300 min，表明軟膠囊在到達(dá)結(jié)腸時(shí)就已崩解，不能達(dá)到結(jié)腸溶性膠囊的工藝要求。5%及8%的甲醛溶液浸泡1.0 h及2.0 h后，膠囊崩解時(shí)間都無(wú)法達(dá)到結(jié)腸溶性要求。浸泡在10%的甲醛溶液，膠囊的崩解時(shí)間超過(guò)300 min，可滿足結(jié)腸溶性條件。考慮到應(yīng)盡量減少甲醛殘留，故選擇10%甲醛溶液處理軟膠囊。

圖1 甲醛浸泡0.5，1.0，2.0 h的軟膠囊崩解時(shí)間變化

結(jié)腸溶性基準(zhǔn)判斷：取浸泡后的軟膠囊，每次6粒，放入崩解儀器中。在人工胃液中崩解2 h，用少量蒸餾水沖洗，置人工腸液中崩解3 h，取出，放入人造結(jié)腸液中進(jìn)行崩解，記錄最終的崩解時(shí)間。如軟膠囊到達(dá)結(jié)腸溶液并崩解，則證明其符合結(jié)腸溶性要求。

2.2 便秘家兔造模及處理

造模：選取16只健康家兔并稱重。隨機(jī)選取4只家兔作為空白對(duì)照組，給予生理鹽水；其他12只家兔被用作便秘組，每天2 mL鹽酸洛哌丁胺生理鹽水（按4.0 mg／kg體質(zhì)量將鹽酸洛哌丁胺溶于2 mL生理鹽水）灌胃，連續(xù)灌胃4 d制作便秘模型[15]。判斷模型是否成功的依據(jù)有家兔食物攝入量、飲水量、體質(zhì)量增加，排便次數(shù)和糞便含水量5個(gè)指標(biāo)。與空白對(duì)照組相比，如果上述指標(biāo)均顯著下降，則證明造模成功。

糞便形態(tài)觀察：每天定期觀察家兔糞便，描述不同時(shí)期家兔糞便、便秘的癥狀[16]。記錄24 h內(nèi)的飲水量、采食量、體質(zhì)量變化和糞便顆粒數(shù)。每天收集的糞便立即稱重，以防止水分流失并導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤。然后將糞便在80℃下干燥8 h至恒重。稱量糞便的質(zhì)量并計(jì)算含水量，按含水量／%=（m1-m2）／m1×100%[17]，m1為糞便鮮重（g），m2為糞便干重（g）。結(jié)果見圖 2。A 組正常，家兔糞便呈球形，大小相似，整齊，但模型組糞便形狀不齊整，較小，可能為便秘引起。

正常組和造模組指標(biāo)比較：由表1可知，便秘組家兔食物攝入量和水?dāng)z入量顯著減少，因此導(dǎo)致體質(zhì)量增加較慢。提示便秘家兔由于便秘導(dǎo)致食欲不振和生長(zhǎng)緩慢。此外，便秘組家兔的排便數(shù)量和糞便含水量也顯著低于空白對(duì)照組，證明便秘造模組的家兔排便不暢，并伴有糞便干結(jié)等癥狀，可判斷造模成功。

圖2 造模后家兔糞便外觀對(duì)比

表1 空白對(duì)照組和便秘造模組指標(biāo)比較（± s，n=4）

表1 空白對(duì)照組和便秘造模組指標(biāo)比較（± s，n=4）

注：與空白對(duì)照組相比，*P ＜0.05，#P ＜0.01。

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2.3 喂食家兔效果試驗(yàn)

家兔分組及處理：將造模成功的12只家兔分為模型對(duì)照組（B組）、陽(yáng)性對(duì)照組（C組）和HD雙歧桿菌結(jié)腸溶性軟膠囊組（D組），空白對(duì)照組（A組）和B組喂食正常，其余2組分別給予雙歧桿菌活菌膠囊和HD雙歧桿菌結(jié)腸溶性軟膠囊，膠囊中含有相同數(shù)量的雙歧桿菌數(shù)（均為 1×108cfu）。

糞便形態(tài)：由圖3可見，D組家兔的糞便在7 d后大小相似并且形狀均勻，幾乎與正常兔無(wú)法區(qū)分，便秘癥狀消失；C組喂飼后糞便的形態(tài)、大小接近正常，但存在一些條帶，便秘癥狀并未完全消失。表明雙歧桿菌結(jié)腸溶性軟膠囊對(duì)便秘的療效更好。

圖3 給藥后家兔糞便外觀比較

采食量、水?dāng)z入量、體質(zhì)量增加量：結(jié)果見表 2。D組家兔食物攝入量和攝水量均顯著高于B組，與A組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與C組相比，D組食物攝入量顯著增加，但水?dāng)z入量無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與A組相比，D組體質(zhì)量增加量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，HD雙歧桿菌結(jié)腸溶性軟膠囊可顯著改善便秘家兔的食物攝入和水?dāng)z入量，不會(huì)阻礙家兔的生長(zhǎng)，因此與正常家兔無(wú)明顯差異。

排便粒數(shù)和糞便含水量：結(jié)果見表 2。與B組相比，C組和D組糞便粒數(shù)顯著增加，D組與A組糞便粒數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。但與A組相比，C組無(wú)顯著增加排便量，且未恢復(fù)到正常排便狀態(tài)。D組便秘兔的糞便粒數(shù)和含水量明顯增加，具有明顯的改善便秘作用。

表2 4組家兔觀察指標(biāo)比較（± s，n=4）

表2 4組家兔觀察指標(biāo)比較（± s，n=4）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＞0.05。圖4同。

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2.4 家兔腸道菌群變化試驗(yàn)

采集實(shí)驗(yàn)第1天、建模后第5天和給藥后的第7天的家兔新鮮糞便4～6粒。用無(wú)菌鑷子挑取新鮮糞便0.1 g，加入0.9 mL生理鹽水中，漩渦振蕩1 min。進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，每次選擇10-2到10-5的稀釋度，分別接種于 TPY，LBS，PS，EMB，YEPD 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48～72 h后，計(jì)算糞便中大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、酵母菌及消化球菌的活菌數(shù)（cfu／g）[18]。

結(jié)果見圖 4。造模前所有家兔的腸道菌群無(wú)明顯差異，腸道菌群正常，可以開始實(shí)驗(yàn)。造模后，除A組外，各組家兔腸道菌群中大腸桿菌和酵母菌增多，雙歧桿菌、乳酸桿菌和消化球菌均顯著減少（P＜0.05），表明便秘家兔腸道菌群紊亂，有害菌增加，有益菌減少。給藥7 d后，與B組相比，D組乳酸桿菌和消化球菌顯著增加，大腸桿菌、酵母菌顯著減少。結(jié)果表明，HD雙歧桿菌結(jié)腸溶性軟膠囊能調(diào)節(jié)便秘家兔腸道菌群平衡。在C組家兔腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌和消化球菌的數(shù)量增加，但差異不顯著（P＞0.05），大腸桿菌數(shù)量減少。因此，HD雙歧桿菌結(jié)腸軟膠囊對(duì)治療便秘和調(diào)節(jié)兔腸道菌群平衡具有顯著作用。

3 討論

本研究中，D組在給予受試藥品7 d后與B組比較，便秘家兔的糞便粒數(shù)顯著增加，糞便含水量提高，說(shuō)明HD雙歧桿菌結(jié)腸溶性軟膠囊具有潤(rùn)腸通便作用，可增強(qiáng)家兔的腸道蠕動(dòng)能力，促進(jìn)腸道內(nèi)積累的糞便排出，因而能緩解家兔便秘癥狀。對(duì)家兔糞便中菌群進(jìn)行細(xì)致分析，與B組相比，D組家兔腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量明顯減少，這可能是由于雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的大量有機(jī)酸等物質(zhì)可促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、增加腸管內(nèi)的滲透壓、分泌水分，從而產(chǎn)生通便效果[19]。與C組相比，HD雙歧桿菌可更有效地增加家兔腸道中乳酸桿菌，雙歧桿菌和消化道球菌的數(shù)量，并減少大腸桿菌的數(shù)量。同是雙歧桿菌膠囊，HD雙歧桿菌腸溶軟膠囊效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥的原因主要有2個(gè)方面：所用雙歧菌體活性高于雙歧桿菌活菌膠囊；HD雙歧桿菌腸溶軟膠囊中具有大豆油載體，可起到物理潤(rùn)腸作用。

圖4 4組家兔腸道菌群比較

采用家兔主要是考慮喂飼方便，實(shí)際上與人應(yīng)用活菌制劑的情況仍有一定差異。所用的HD雙歧桿菌結(jié)腸溶性軟膠囊的結(jié)腸溶性是仿照人的代謝時(shí)間對(duì)囊殼進(jìn)行處理而得到的，對(duì)家兔是否具有結(jié)腸溶性不得而知，還需測(cè)定其糞便中的脂肪含量，再綜合各項(xiàng)指標(biāo)，以便為HD雙歧桿菌結(jié)腸溶性軟膠囊改善便秘的機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。