朱強 葉樹鳴 楊震 梁志欣 李春筍 陳良安

1解放軍總醫(yī)院呼吸科，北京100853；2武漢市第一醫(yī)院呼吸科430022

ARDS是臨床常見且難治的急性危重癥，病死率高達50%左右[1]，嚴重感染是ARDS最常見的原因之一，約有40%～50%的ARDS患者與感染或膿毒癥有關[2]。脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)是臨床感染中占大多數(shù)的革蘭陰性桿菌外膜上的主要成分。當LPS入侵肺部時，它能結合細胞表面的CD14受體，與宿主細胞相互作用后使細胞產(chǎn)生大量的細胞因子與炎性介質(zhì)直接損傷肺泡細胞，引起肺泡上皮屏障的破壞，導致肺水腫，從而促進ARDS的發(fā)生、發(fā)展。

全氟化碳 (perfluorocarbon，PFC)是碳氫化合物中的氫原子被氟原子取代后形成的一類化合物，常溫下為無色、無味、無毒的透明液體，黏度低于血液而稍高于水，不溶于血液、水、脂類及其他介質(zhì)，密度高，表面張力低，化學性質(zhì)穩(wěn)定，在體內(nèi)不發(fā)生代謝。由于PFC分子間吸引力小，分子不易聚集，分子間的疏松堆積使它有較大空間供氣體分子自由進出，因此它具有良好的呼吸氣體運載能力。對氧的溶解和釋放可在10 ms內(nèi)完成，并且這個過程是可逆的，比人血紅蛋白所需要的30 ms要快得多；其對二氧化碳的溶解和釋放的時間更短，為4 ms，并且也是可逆過程。PFC溶氧能力是水的20～25倍，血液的2倍，其溶解二氧化碳的能力是水的3倍多。目前，有研究表明PFC通過液體通氣、霧化吸入及氣化通氣可顯著改善ARDS的氧合，減輕炎癥反應，降低死亡率[3-4]，然而其具體機制尚不明確。本研究應用LPS作用于人肺上皮樣A549細胞模仿ARDS體外細胞模型，觀察PFC對LPS致A549細胞損傷的生物學影響，以期為ARDS的防治提供更多的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)細胞系：傳代培養(yǎng)人肺上皮樣A549細胞由本實驗室收藏。 (2)主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、LPS(E.coli 026：B6)、DMSO、PFC、PBS、無水乙醇、RNAiso Plus(總 RNA提取試劑盒)、PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMII、RNA free dd H2O、三氯甲烷、異丙醇、DEPC。 (3)實驗儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱、IX-81顯微鏡、超凈工作臺、低速離心機 (TDZ4-WS)、流式細胞儀FACS Callibur、-20℃低溫冰箱、-80℃超低溫冰箱、6孔細胞培養(yǎng)板、12孔細胞培養(yǎng)板、24孔細胞培養(yǎng)板、XSZ-D2型倒置顯微鏡、JY92-2D型超聲細胞粉碎儀、電熱恒溫水浴鍋、血細胞計數(shù)板 (XB-K-25型)、液氮罐、移液器、高壓滅菌鍋、微型離心機、高速低溫離心機、PCR儀 (MJ Mini)、熒光定量RCR儀 (BIORAD iQ5)、核酸蛋白定量分析儀。

1.2 主要溶液配制 (1)0.25%胰蛋白酶的配制：稱取胰蛋白酶干粉2.5 g加入1 000 ml D-Han's液中，將其置于37℃水浴下使其完全溶解，在無菌條件下，使用0.45μm和0.22μm雙層濾膜過濾除菌，將配置好的胰蛋白酶分裝于100 ml無菌瓶中，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)PBS的配制：稱取粉劑6 g置于500 ml滅菌水中，配制成0.01 mol/L的溶液，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?(3)LPS溶液：將LPS 10 mg加10 ml無血清培養(yǎng)液溶解，使其濃度為1 g/L，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 A549細胞系的培養(yǎng)

1.3.1.1 凍存細胞的復蘇 從液氮罐中取出裝有A549細胞的凍存管，將其迅速置于37℃的水浴中，使凍存細胞快速融化，無菌條件下將2 ml凍存管中的細胞懸液移入10 ml無菌離心管中，向離心管中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液4 ml，離心半徑15 cm，1 000 r/min離心5 min(其目的為洗去凍存液中的DMSO)，棄去上清液，重復洗滌離心1次，細胞沉淀用4 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸后，無菌條件下轉移入培養(yǎng)皿中，置于37℃含5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。12 h和24 h后分別于倒置顯微鏡下觀察細胞是否貼壁生長。

1.3.1.2 細胞培養(yǎng) A549細胞置于37℃含5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞貼壁生長，每次細胞換液時直接棄去培養(yǎng)液，再加入新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.3.1.3 細胞傳代 倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞長滿培養(yǎng)皿底后進行傳代。棄去DMEM培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入約1 ml 0.25%含EDTA的胰蛋白酶溶液，將細胞放入培養(yǎng)箱，約2～5 min后于倒置顯微鏡下觀察到貼壁胞質(zhì)回縮、細胞間隙變大。細胞變?yōu)閳A形后，棄去培養(yǎng)瓶中的胰蛋白酶，迅速加入約2～3 ml含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，終止胰蛋白酶消化作用。用吸管反復吹打瓶底使貼壁細胞懸浮，盡量將細胞吹打為單細胞懸液，將懸浮的單細胞懸液等量移入2～3個培養(yǎng)皿中，向每個培養(yǎng)皿中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基約7～8 ml，置于37℃含5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3.1.4 細胞凍存 取對數(shù)生長期細胞，棄去培養(yǎng)液，0.25%的胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吸管反復吹打貼壁細胞使細胞懸浮，將細胞懸液移入10 ml離心管中，離心半徑15 cm，1 000 r/min離心5 min，加入配制好的含10%DMSO的凍存培養(yǎng)液，使凍存液中細胞的最終濃度為5×106～1×107/ml，用吸管移入凍存管中，標記后，-20℃放置1 h，-70℃放置5 h后，移入液氮罐中保存。

1.3.1.5 細胞計數(shù) 將蓋玻片蓋在血細胞計數(shù)板上，取10μl細胞懸液加入90μl PBS中稀釋后，滴加少量稀釋液于蓋玻片邊緣，靜置1 min。于倒置顯微鏡下計數(shù)4大格的細胞總數(shù)。細胞數(shù)(個/ml)=4大格細胞總數(shù)/4×10×104。

1.3.2 LPS致A549細胞損傷模型的建立

1.3.2.1 細胞分組及培養(yǎng) 將A549細胞接種于細胞培養(yǎng)板中，待其生長達80%融合度時，對照組加入完全培養(yǎng)基，LPS組加入LPS及完全培養(yǎng)基，使LPS終濃度為100 mg/L。分別于加入LPS后0、1、2、4、6、8、10、12、24 h檢測A549細胞相關損傷指標。

1.3.2.2 提取細胞總RNA 采用TAKARA公司的RNAiso Plus試劑盒提取A549細胞總RNA。具體步驟：(1)去除培養(yǎng)基，PBS清洗1次。按每10 cm2生長細胞中加入1 ml RNAiso Plus，輕輕搖晃，使裂解液均勻分布于細胞表面。(2)將含有細胞的裂解液轉移至離心管中，移液槍反復吹打至裂解液中無明顯沉淀，室溫靜置5 min。(3)向裂解液中按1∶5體積比加入氯仿，用力混合至溶液乳化呈乳白色，室溫靜置5 min。(4)4℃，離心半徑15 cm，12 000 r/min離心15 min。取出離心管，此時勻漿液分為3層：無色上清液 (含RNA)、居于中間的白色蛋白層及下層的紅色有機相。(5)轉移上清液至另一離心管中，同時計算產(chǎn)量。(6)上清液中加入等體積異丙醇，上下輕輕顛倒離心管，充分混勻后，室溫靜置10 min。 (7)4℃，離心半徑15 cm，12 000 r/min離心10 min。(8)小心棄去上清。加入75%乙醇1 ml，輕輕震蕩洗滌離心管管壁，4℃，離心半徑15 cm，7 500 r/min離心5 min，小心棄去上清。(9)打開離心管蓋，室溫干燥沉淀。待沉淀干燥后，加入適量的RNase-free dd H2O溶解沉淀。(10)RNA溶解后置于冰上繼續(xù)下一步實驗。

1.3.2.3 RNA純度測定 RNase-free dd H2O稀釋RNA，其后應用核酸蛋白質(zhì)定量分析儀測定吸光度以及RNA濃度，OD260/OD280比值應介于1.7～2.1之間。

1.3.2.4 反轉錄反應 采用TAKARA公司PrimeScript?RT reagent Kit進行反轉錄反應合成cDNA。(1)祛除基因組DNA。反應體系：總RNA 1.0μg，5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，RNase-free dd H2O 6μl。反應條件：42℃2 min。(2)反轉錄反應。反應體系：第一步反應液10μl，5×PrimeScript?Buffer2 4μl，PrimeScript?RT Enzyme Mix I 1μl，RNase-free dd H2O 4μl，RT Primer Mix4 1μl。反應條件：37℃15 min，85℃5 s。反應合成的c DNA直接進行下一步實驗。

1.3.2.5 引物設計 搜索Genebank，對IL-6(ACCESSION： NM_000600.3) 及 β-actin(ACCESSION：NM 001101.3)的基因序列應用Primer BLAST進行引物設計。IL-6上游引物：5'-CCAGAGCTGTGCAGATGAGT-3'，下 游 引物：5'-AGTTGTCATGTCCTGCAGCC-3'，擴增產(chǎn)物長度為155 bp。β-actin(內(nèi)參)上游引物：5'-CAAAGACCTGTACGCCAACACAGT-3'，下游引物：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATCT-3'，擴增產(chǎn)物長度為215 bp。

1.3.2.6 熒光實時定量PCR 采用TAKARA公司SYBR?Premix Ex TaqTMII進行實時定量PCR反應。反應體系：DNA模板1.5μmol/L，dd H2O 6.9μl，SYBR?Premix Ex TaqTMII 10μl，上游引物 (10μmol/L)0.8μl，下游引物 (10μmol/L)0.8μl。

反應條件：兩步法PCR擴增程序。Stage 1(預變性)：95℃30 s，20℃/s，1 Cycle。Stage 2(PCR反應)：95℃5 s，20℃/s；60℃20 s，20℃/s，40 Cycles。Stage 3(融解曲線分析)：95℃30 s，20℃/s；65℃15 s，20℃/s；95℃30 s，0.1℃/s。

1.3.3 觀察指標

1.3.3.1 細胞分組 實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。細胞分為4組。(1)對照組：不作任何干預；(2)PFC組：按10%體積比 (PFC∶培養(yǎng)液)加入全氟辛烷，使用超聲波將PFC與培養(yǎng)液混勻，轉入培養(yǎng)皿中；(3)LPS組：干預時以100 mg/L的終濃度加入相應劑量的LPS； (4)LPS+PFC組：以LPS的終濃度為100 mg/L、PFC的體積比為10%加入DMEM培養(yǎng)基，通過超聲波混勻，加入培養(yǎng)皿 (表1)。

表1 實驗細胞分組及處理方法(加入相應試劑劑量，μl)

1.3.3.2 顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 取對數(shù)生長期細胞，消化后將細胞懸液平均接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，24 h后按以上分組給予相應處理。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)改變并拍照記錄。

1.3.3.3 細胞生長曲線的繪制 細胞分組同形態(tài)學觀察實驗。采用細胞計數(shù)法檢測各組A549細胞的增殖能力：(1)胰蛋白酶消化A549細胞制成單細胞懸液；(2)細胞計數(shù)后以每孔4×104接種于12孔板中； (3)37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；(4)24 h后按不同分組給予相應處理； (5)從加藥后第1天開始，每組每天計數(shù)細胞3個復孔，連續(xù)6 d；(6)實驗重復3次，繪制細胞生長曲線。

1.4 統(tǒng)計學分析 熒光實時定量PCR結果使用2-ΔΔCt方法計算。其余統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件包，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)分布性檢驗 (Klmogorov-Smirnov test)，以確定數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布；并進行方差齊性檢驗 (Bartle法)以確定總體方差是否相等。將所得數(shù)據(jù)分別進行方差分析 (正態(tài)方差齊者用Bonferroni法，正態(tài)方差不齊者用Tamhane法)，數(shù)據(jù)以±s表示，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-6 m RNA表達水平 LPS刺激A549細胞后，各時間點LPS組與對照組 (0 h)IL-6 m RNA表達的差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，見表2、圖1。

表2 脂多糖刺激A549細胞后各時間點IL-6 m RNA相對表達量的變化 (±s，n=3)

表2 脂多糖刺激A549細胞后各時間點IL-6 m RNA相對表達量的變化 (±s，n=3)

時間 (h) IL-6 mRNA相對表達量0 1.00 2.03±0.75 2 4.06±1.25 4 16.00±2.21 6 6.41±1.24 8 5.24±1.15 10 3.55±1.33 12 2.30±0.77 24 2.10±0.19 1

圖1 脂多糖刺激A549細胞后不同時間點IL-6 m RNA相對表達水平的變化

2.2 各組A549細胞形態(tài)學變化 各組A549細胞均呈上皮樣細胞貼壁生長。對照組、PFC組及LPS+PFC組細胞形態(tài)飽滿，排列緊密，生長狀態(tài)良好。LPS組細胞明顯稀疏，細胞形態(tài)皺縮，體積變小，部分細胞呈圓形，生長狀態(tài)變差。見圖2～4。

2.3 各組A549細胞增殖能力的變化 從加藥后第4天起，LPS組與其他組細胞數(shù)目的差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，即LPS明顯抑制了A549細胞的增殖能力，而PFC明顯減弱了LPS的抑制效應。PFC組與對照組的細胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義，因此PFC本身對A549細胞的增殖無影響。見表3、圖5。

3 討論

ARDS是臨床上常見的危重癥，目前臨床治療尚未取得突破性進展，機械通氣仍是其最主要的治

圖2 加入LPS或PFC后24 h各組A549細胞形態(tài) ×100 A：對照組；B：LPS組；C：PFC組；D：LPS+PFC組

圖3 加入LPS或PFC后48 h各組A549細胞形態(tài) ×100 A：對照組；B：LPS組；C：PFC組；D：LPS+PFC組

圖4 加入LPS或PFC后72 h各組A549細胞形態(tài) ×100 A：對照組；B：LPS組；C：PFC組；D：LPS+PFC組

表3 各組A549細胞的數(shù)目 (±s)

表3 各組A549細胞的數(shù)目 (±s)

注：LPS為脂多糖；PFC為全氟化碳；與對照組比較，a P＜0.01；與PFC組比較，b P＜0.05，c P＜0.01；與LPS+PFC組比較，d P＜0.05

組別 樣本數(shù)細胞數(shù)目 (×104/ml)1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d對照組 3 5.8±1.02 11.0±1.54 15.5±2.12 25.1±2.96 27.7±3.37 30.3±3.51 LPS組 3 6.4±1.13 9.1±1.25 12.9±1.58b 16.5±1.92acd 18.8±2.18acd 22.1±2.52abd PFC組 3 5.2±0.98 10.4±1.32 17.6±2.17 24.8±2.78 26.9±3.05 28.9±3.18 LPS+PFC組 3 5.4±0.96 10.6±1.09 14.4±1.78 22.4±2.62 24.3±2.81 26.8±2.97

療措施。在藥物治療方面，大部分治療措施著重于控制炎癥反應[5]。盡管肺損傷的發(fā)展取決于炎癥介質(zhì)對內(nèi)皮細胞的損傷[6]，其嚴重程度及恢復卻依賴于上皮細胞的功能[7]。事實上，肺損傷最為顯著的病理學改變是彌漫性肺泡上皮損傷[8-9]；生理學上亦發(fā)現(xiàn)肺泡上皮結構與功能的完整性是肺損傷嚴重程度的重要決定因素[10]；此外，肺泡上皮也是肺泡水腫液再吸收的位點，其在與ARDS相關的肺纖維變性中扮演重要角色[11-13]，當肺泡上皮細胞未能有效修復時，缺損部位便被纖維細胞替代，從而導致肺纖維化。因此，以改善肺泡上皮細胞功能為目標的治療措施可能是加速肺損傷的修復及降低ARDS病死率的關鍵因素。

圖5 各組A549細胞生長曲線

目前，由于PFC的理化和生物學特性，它已經(jīng)廣泛應用于完全液體通氣及部分液體通氣治療ARDS，并取得良好效果[14-15]。國內(nèi)外多項研究報道[16-18]PFC治療ARDS可能有以下機制：(1)具有較高的攜氧及二氧化碳能力，在肺內(nèi)起著氣體轉運的作用；(2)在肺泡內(nèi)形成PFC薄層，通過其低表面張力的特性發(fā)揮表面活性物質(zhì)樣作用，從而復張萎陷的肺泡，提高肺順應性；(3)由于PFC的重力作用，其主要進入重力依賴區(qū)，壓迫肺血管，使肺下垂部位的血流相對減少，從而改善肺內(nèi)通氣/血流比；(4)促進肺內(nèi)源性肺泡表面活性物質(zhì)產(chǎn)生；(5)有利于肺泡及小氣道分泌物的排出；(6)抑制肺組織的炎性反應，防止或減輕肺損傷；(7)有穩(wěn)定細胞膜及抑制肺內(nèi)炎性介質(zhì)及細胞因子釋放的作用；(8)一定程度上抑制呼吸道細菌生長繁殖[19]。但目前國內(nèi)外尚無PFC治療ARDS的細胞生物學研究報道。

PFC治療ARDS的細胞生物學研究主要關注的是細胞形態(tài)、增殖、遷移及凋亡等方面的變化，而肺泡上皮細胞的以上生物學功能在肺損傷的修復中發(fā)揮重要作用。鑒于此，本研究從細胞生物學角度探討了PFC對LPS誘導A549細胞損傷的保護作用，試圖為臨床應用PFC治療ARDS提供細胞生物學理論依據(jù)。

細胞形態(tài)學是反映細胞生長狀態(tài)最為直觀的指標。本研究通過形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)LPS作用于A549細胞使其形態(tài)皺縮，生長狀態(tài)變差，PFC本身對其形態(tài)無明顯影響，當PFC與LPS共同孵育A549細胞時，能夠顯著改善LPS對其形態(tài)及生長狀態(tài)的不良影響。

細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是細胞生物學特性的基本參數(shù)之一。本研究應用細胞計數(shù)法繪制生長曲線，發(fā)現(xiàn)LPS能夠明顯抑制A549細胞的增殖能力，而PFC本身對其增殖能力沒有影響，當PFC與LPS共同孵育A549細胞時，能夠顯著改善LPS對其增殖的抑制作用。

綜上所述，本研究證實LPS作用于A549細胞能夠使其形態(tài)皺縮，生長狀態(tài)變差，且能夠明顯抑制其增殖能力及遷移能力，并因此抑制其損傷的修復，而PFC能夠明顯減輕LPS誘導的以上損傷改變，進而促進A549細胞的損傷修復能力。PFC對LPS導致的A549細胞損傷產(chǎn)生的以上保護作用，可能是其在既往的臨床研究及動物實驗中發(fā)揮保護作用的機制之一，其分子機制尚有待進一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突