李 紅，童光磊，張 敏，鮑勁松，李司南，周陶成，易 昕，蔡云飛，董文旭，陳露露，康倩倩，陳 婧

發(fā)育遲緩/智力低下(developmental delay/intellectual disability,DD/ID)是一組在18周歲前發(fā)病，以認知功能障礙和社會適應能力缺陷為特征的疾病。一般人群中的發(fā)病率較高，為1%～3%[1]。DD/ID的病因較為復雜，主要包括非遺傳因素和遺傳因素[2]。近年來，國際臨床遺傳學會(international collaboration for clinical genoemics,ICCG)、國際標準細胞基因組微陣列(international standard for cytogenomic array,ISCA)學會以及美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(American college of medical genetics and genomics,ACMG)等將染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)作為DD/ID患兒的一線臨床診斷方法[3-4]，染色體微陣列分析是近幾年迅速發(fā)展起來的一項分子檢測技術(shù)，能覆蓋全基因組DNA，具有高通量、高分辨率、檢測速度快的特點。該研究對210例DD/ID患兒進行了CMA檢測，以探討其在診斷、治療、預后、評估DD/ID患兒方面的價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2016年1月1日～2018年8月30日在安徽省兒童醫(yī)院神經(jīng)康復科就診，被確診為DD/ID的210例患兒臨床資料，年齡在2月～10歲。入選標準:① 采用以下測評量表測評：0～4歲使用蓋塞爾發(fā)育商量表中文修訂版(Gessell development scale)；4～6歲使用學前和學齡初期中國韋氏兒童智力量表(Chinese Wechsler preschool and primary scale intelligence，WPPSI)；>6歲使用中國韋氏兒童智力量表(Chinese Weehsler intelligence scale for children，C-WISC)；嬰兒初中學生社會生活能力量表；智力商數(shù)(intelligence quotient，IQ)/發(fā)育商數(shù)(developmental quotient，DQ)<70分，同時伴社會適應性能力缺陷者診斷為智力低下?；純喊榛蛘卟话樯L遲緩等其他表現(xiàn)；② 排除顱內(nèi)出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、宮內(nèi)窘迫等影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)病史；③ 排除脆性X綜合征、苯丙酮尿癥、三體綜合癥等已知遺傳因素導致的智力低下。根據(jù)是否合并其他異常將DD/ID患兒分成2組，分別為單純性DD/ID組和合并其他異常組120例(合并癲癇、合并頭顱磁共振異常、合并心血管系統(tǒng)、合并多發(fā)結(jié)構(gòu)畸形)。所有家長接受檢測前遺傳咨詢及簽署知情同意書，該研究獲該中心醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1標本采集及處理 采集患兒靜脈血2 ml，EDTA抗凝管2～8 ℃保存運輸，用于CMV檢測。

1.2.2基因組DNA提取 DNA提取試劑盒與提取儀(Lab-Aid820核酸提取儀)購自廈門致善生物科技有限公司；SNParay芯片及掃描儀購自美國Ilumina公司。

1.2.3染色體微陣列檢測 嚴格按照操作說明，應用珀金埃爾默醫(yī)學檢驗所用含有60 K寡核苷酸探針的CGX v1.1芯片進行染色體片段重復/缺失檢測，應用Iluminaiscan進行芯片掃描、GenomeStudio軟件進行數(shù)據(jù)處理。從軟件分析的結(jié)果中，選擇>100 kb的重復或缺失片段進行下一步分析；對照原始圖像檢測假陽性和假陰性結(jié)果；除外在健康人群拷貝數(shù)變異(copynumbervariations,CNVs)多態(tài)性的片段；除外片段區(qū)域內(nèi)不包含基因的CNVs。查閱4種常用國際病理性CNV數(shù)據(jù)庫：ClinVar(htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、Decipher(htps://decipher.sanger.ac.uk/)、OMIM(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)和健康人群DGV數(shù)據(jù)庫(database of genomic variants, htps://projects.tcag.ca/variatin)，并檢查 PubMed數(shù)據(jù)庫相關(guān)文獻對檢出的CNVs致病性進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理應用SPSS 16.0軟件進行分析，兩組率或多組率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CMA結(jié)果CMA分析顯示210例DD/ID患兒的基因組都存在CNVs，每例患者基因組含1～10個CNVs，片段大小50 kb～50 Mb不等，CMA在83例患兒中檢測到染色體拷貝數(shù)異常，檢出率為39.5%(83/210)。其中，檢出已知致病的常見微缺失/微重復綜合征66例(79.5%，66/83)，見表1；罕見綜合征1例(1.2%，1/83，Kleefstra綜合征)，見圖1。可疑致病變異的微缺失/微重復9例(10.8%，9/83)，可能良性變異1例(1.2%，1/83)，臨床意義不明6例(7.2%，6/83)。

2.2 分組及致病性CNVs的檢出率臨床患兒的表型并不單一，根據(jù)伴或不伴其他異常DD/ID患兒分為2組，單純性DD/ID組90例，復雜性DD/ID組120例(合并癲癇23例，頭顱磁共振異常36例，心血管系統(tǒng)19例、多發(fā)結(jié)構(gòu)畸形42例)。并對兩組檢出率進行統(tǒng)計分析(表2)。

3 討論

CMA能夠分析全基因組范圍的微缺失或微重復(<5 Mb)、雜合性缺失及單親二倍體等，目前已成為不明原因發(fā)育遲緩、智力障礙、多發(fā)先天性畸形等多種疾病的首選檢測技術(shù)[5]。目前越來越多的研究將CMA作為DD/ID患者的一線檢測技術(shù)應用于臨床診斷中，但所用的平臺不盡相同，致病性CNVs檢出率也存在差異性。Coutton et al[6]應用Human Genome CGH Microarray Kit 180K技術(shù)平臺對66例DD患者進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病性CNVs的檢出率為21%。王榮躍 等[7]應用CytoScan750K對489例DD/ID患兒進行檢測，結(jié)果顯示致病性CNVs的檢出率為25.8%。袁海明 等[8]應用CytoScanHD(195萬CNV探針+75萬SNP探針)芯片對2 000例出生缺陷患兒進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病性CNVs的檢出率為21.6%。本研究的210例DD/ID患兒結(jié)果顯示，致病性CNVs的檢出率為39.5%，檢出率高于國內(nèi)外文獻報道，證明了CMA技術(shù)可以彌補傳統(tǒng)核型分析技術(shù)和FISH技術(shù)的不足，提高微小致病性CNVs的檢出率。

表1 檢測出的臨床致病性微缺失/微重復綜合征在染色體的分布

圖1 1例罕見微缺失/重復綜合征的CMA結(jié)果圖

表2 210例患兒分組及致病性CNVs的檢出率[n(%)]

研究中67例致病性CNVs，66例(31.4%，66/210)為常見微缺失/微重復綜合征，陽性例數(shù)大于3例的為Angelman/Prader-Willi綜合征10例、22q13.3微缺失綜合征5例、佩梅病3例(Pelizaeus-Merzbacher disease，PMD)。Angelman/Prader-Willi綜合征多見兒童，表現(xiàn)為快樂表情、發(fā)育遲緩、語言障礙、孤獨內(nèi)向、智力兒童低下，癲癇發(fā)作；其臨床表現(xiàn)與染色體異常具有密切聯(lián)系，染色體15q11-q13區(qū)段的UBE3A基因異常是該病發(fā)生的主要因素，不同的突變類型有不同程度的表現(xiàn)，缺失片段的大小與表型具有相關(guān)性[9-10]。研究中Angelman/Prader-Willi綜合征中6例屬于單純組，4例屬于復雜組，說明并不是疾病復雜的發(fā)病率就高。PMD致病基因位于Xq22.2的PLPl基因，該基因缺陷可以導致髓鞘形成異常和(或)少突膠質(zhì)細胞死亡，使得腦內(nèi)廣泛白質(zhì)區(qū)域髓鞘缺乏或減少是累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的進展性遺傳性疾病，頭顱MRI對本病診斷意義重大，可顯示為髓鞘化異常，T2加權(quán)像和Flair像彌漫性高信號[11]，研究的3例PMD均屬于合并磁共振異常組，建議臨床醫(yī)師對發(fā)育遲緩，頭顱MRI白質(zhì)異常患兒要排除此病，進行基因芯片檢查。

檢出Kleefstra綜合征1例， Kleefstra綜合征是比較罕見的基因組學疾病，由染色體區(qū)域9q34.3(85%的病例)中的微缺失或由編碼的常染色質(zhì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1的EHMT1基因突變引起的[12]。本例患兒為12個月女孩，主要表現(xiàn)生長發(fā)育遲緩，智力低下，先天性心肌病，特殊面容不明顯。CMA在染色體9q34.3區(qū)段檢出190 Kb缺失，數(shù)據(jù)庫提示為Kleefstra綜合征。該綜合征患者在國內(nèi)尚未見報道，不僅豐富了Kleefstra綜合征基因型-表型譜，還為治療和預后評估提供了遺傳學依據(jù)。

本研究對單純性DD/ID組與復雜性DD/ID組致病性CNVs檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義。說明DD/ID的臨床表型具有多樣性，沒有特異性。

CMA仍具有局限性：① 無法檢測染色體的平衡性改變；② 無法檢測單基因病，進一步高通量測序可彌補基因突變而導致的漏診。CMA可檢測出核型分析無法識別的微缺失/微重復綜合征，還具有發(fā)現(xiàn)新的可疑致病性基因的能力，但新發(fā)致病基因的確定要結(jié)合父母的DNA分析，本研究中不足點是沒有開展父母DNA的CMA檢測工作。CMA為DD/ID疾病的診斷、咨詢、治療、預后評估以及疾病的再發(fā)風險評估提供了遺傳學依據(jù)。