賽 愷，余昌俊

直腸癌(rectal cancer, RC)是常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤，當(dāng)前根治性手術(shù)仍然是其主要的治療方法，但仍有40%～50%的患者因術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡[1]。尋找預(yù)測(cè)預(yù)后的有效生物學(xué)指標(biāo)是當(dāng)下RC診療的研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-erythroid 2，NF-E2)相關(guān)因子3(NF-E2-related factor 3，NFE2L3，又稱Nrf3)是NF-E2家族的第三個(gè)家族成員，主要的生物學(xué)作用是誘導(dǎo)抗氧化作用基因的表達(dá)[2]。近期有研究表明[3-5]，NFE2L3在血液系統(tǒng)、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈顯著高表達(dá)，且與患者預(yù)后有著密切關(guān)系，但NFE2L3在RC中的表達(dá)及預(yù)后意義目前仍未見(jiàn)明確報(bào)道。該研究利用免疫組化驗(yàn)證結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的方法探討NFE2L3在RC中的表達(dá)水平及其與臨床預(yù)后指標(biāo)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)選擇癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)[6]和Oncomine[7]進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，具體實(shí)施步驟如下：輸入基因名稱“NFE2L3”和癌癥類型中選擇“直腸腺癌”檢索分析NFE2L3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，按其表達(dá)水平高低降序排列，排名前50%定義為NFE2L3高表達(dá)(46例)，余下定義為NFE2L3低表達(dá)(46例)。運(yùn)用Kaplan-Meier法繪制“NFE2L3基因表達(dá)水平-患者的總生存期(overall survival，OS)關(guān)聯(lián)曲線。

1.2 RC標(biāo)本及患者相關(guān)臨床信息回顧性收集2008年4月～2016年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科的RC患者癌、配對(duì)癌旁組織石蠟標(biāo)本66對(duì)，術(shù)后病理均證實(shí)直腸腺癌?；颊呦嚓P(guān)的臨床信息見(jiàn)表2。本研究已經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批，所有患者已簽署知情同意書。

1.3 免疫組化及結(jié)果判讀相關(guān)標(biāo)本應(yīng)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(streptavidin-perosidade，SP)對(duì)進(jìn)行檢測(cè)。一抗為NFE2L3兔多克隆抗體(貨號(hào)：HPA055889)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，工作濃度為1∶200。染色結(jié)果：利用盲法測(cè)定，兩名病理醫(yī)師對(duì)每一張切片進(jìn)行獨(dú)立判斷，參照此前已報(bào)道的判讀方法[8]，根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(percentage of positive cells，PP)乘以染色強(qiáng)度(staining intensity，SI)的百分比計(jì)算免疫反應(yīng)性評(píng)分(immunoreactive score，IRS)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：SI(0～3分)：0為陰性，1為弱陽(yáng)性，2為中度陽(yáng)性，3為強(qiáng)陽(yáng)性；PP(0～4分)：0為陰性，1為1%～25%，2為26%～50%，3為51%～75%，4為76%～100%。結(jié)合IRS評(píng)分范圍為0 ～12分，若IRS> 4分，定義為NFE2L3高表達(dá)；若IRS≤4分，評(píng)為NFE2L3低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。RC與正常對(duì)照組之間陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法(log-rank test)進(jìn)行單因素生存分析，而后將在單因素生存分析有意義的因素代入進(jìn)行Cox多因素生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NFE2L3在RC中呈顯著高表達(dá)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到含有NFE2L3基因表達(dá)信息的RC 92例，正常對(duì)照318例見(jiàn)圖1A；其中共有5項(xiàng)關(guān)于“直腸癌vs正常對(duì)照組”的研究在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到，該研究涉及到有NFE2L3基因表達(dá)水平的信息見(jiàn)圖1B，結(jié)果均顯示：與正常對(duì)照組比較，NFE2L3基因mRNA在RC中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。經(jīng)免疫組化SP法進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果顯示，NFE2L3蛋白主要表達(dá)于RC細(xì)胞核中，在RC中表達(dá)呈現(xiàn)高表達(dá)(66.7%)顯著低于配對(duì)癌旁正常組織(15.2%)，見(jiàn)圖2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。此蛋白表達(dá)結(jié)果與利用癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的mRNA表達(dá)結(jié)果相一致。

表1 NFE2L3在RC及配對(duì)癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平

2.2 NFE2L3表達(dá)與RC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系隨后，對(duì)RC中NFE2L3差異表達(dá)水平與患者的各項(xiàng)臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)表2。 NFE2L3的差異表達(dá)水平僅與有無(wú)脈管侵犯有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)，而與患者性別、年齡、有無(wú)淋巴結(jié)侵犯、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、TNM分期及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)。

表2 NFE2L3差異表達(dá)水平與RC患者各臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1 癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)NFE2L3基因在RC中高表達(dá)A：GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果；B：Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果；與正常對(duì)照組比較：*P<0.05

圖2 免疫組化法檢測(cè)NFE2L3在RC及癌旁正常組織的蛋白表達(dá)水平 SP×100

A：NFE2L3在癌旁正常組織中低表達(dá)；B：NFE2L3在RC組織中高表達(dá)

2.3 NFE2L3預(yù)測(cè)RC患者臨床預(yù)后的價(jià)值隨后對(duì)RC患者的預(yù)后與NFE2L3基因的差異表達(dá)水平的關(guān)系進(jìn)行研究。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示：RC患者中NFE2L3基因mRNA高表達(dá)者的預(yù)后顯著好于其低表達(dá)患者(P=0.041)，見(jiàn)圖3A，經(jīng)進(jìn)一步免疫組化SP法檢測(cè)得到相似的結(jié)論，RC患者中NFE2L3蛋白高表達(dá)者的總生存時(shí)間顯著好于其低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)，見(jiàn)圖3B；Kaplan-Meier單因素生存分析結(jié)果示：NFE2L3差異表達(dá)水平、脈管侵犯、TNM分期及浸潤(rùn)深度是決定RC患者總生存時(shí)間差異的關(guān)鍵因素，見(jiàn)表3；將該4個(gè)單因素代入Cox多因素生存分析后，顯示如下：NFE2L3表達(dá)水平可作為RC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P=0.012)。見(jiàn)表4。

表3 RC患者的Kaplan-Meier單因素生存分析

圖3 基于NFE2L3表達(dá)水平差異繪制總生存曲線

A：NFE2L3 mRNA表達(dá)水平與總生存期曲線(Kaplan-Meier法)；B：NFE2L3蛋白表達(dá)水平與總生存曲線(Kaplan-Meier法)

表4 RC患者的Cox多因素生存分析值

3 討論

目前在霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、大腸癌、睪丸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)NFE2L3呈現(xiàn)顯著高表達(dá)水平[3-5, 9-10]，但有關(guān)該基因到底扮演著促癌基因還是抑癌基因的角色卻存在著不同的研究發(fā)現(xiàn)。Chevillard et al[11]最早利用NFE2L3基因缺陷的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，該基因缺失后的小鼠對(duì)致癌物苯并芘的敏感性高度增加，其T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病率顯著升高，且死亡率亦增加，提示該轉(zhuǎn)錄因子在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中具有保護(hù)作用，發(fā)揮著抑癌基因的角色。另一方面，Wang et al[10]證實(shí)NFE2L3在胰腺癌中呈明顯高表達(dá)，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)性，且高表達(dá)NFE2L3的患者生存期更短，其機(jī)制與其調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管生成有關(guān)，該結(jié)果提示NFE2L3又具有促癌基因的角色。而在大腸癌的研究中出現(xiàn)了更為有趣的現(xiàn)象：國(guó)內(nèi)學(xué)者[12-14]利用全基因組寡核苷酸技術(shù)篩選出NFE2L3為大腸癌高表達(dá)基因，并在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NFE2L3可抑制大腸癌細(xì)胞株LoVo和肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的細(xì)胞生長(zhǎng)，但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響；國(guó)外Chowdhury et al[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NFE2L3可通過(guò)刺激U2AF同源基序激酶1基因的表達(dá)在體外促進(jìn)大腸癌細(xì)胞株DLD-1的細(xì)胞增殖，但它們?cè)诹硪环N大腸癌細(xì)胞株HCT116中也發(fā)現(xiàn)NFE2L3可顯著抑制其細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)到NFE2L3基因在RC組織中的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.05)；進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化SP法對(duì)66例RC及配對(duì)的癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)顯示：NFE2L3蛋白在RC組織中顯著升高，且與配對(duì)癌旁邊組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。這一真實(shí)數(shù)據(jù)結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，同時(shí)也與NFE2L3基因在前述其它惡性腫瘤中的高表達(dá)情況相吻合。該結(jié)果提示：NFE2L3基因在惡性腫瘤發(fā)展、發(fā)生等生物學(xué)進(jìn)程中起著關(guān)鍵的作用。

繼而對(duì)NFE2L3表達(dá)水平與RC預(yù)后進(jìn)行研究，經(jīng)相關(guān)性分析顯示：NFE2L3的差異表達(dá)與RC患者有無(wú)脈管侵犯有關(guān)；經(jīng)Cox多因素生存分析顯示：NFE2L3基金的高表達(dá)可作為預(yù)測(cè)RC患者預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，該結(jié)果與利用GEPIA公共數(shù)據(jù)庫(kù)直腸癌數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的生存分析結(jié)果相一致，提示NFE2L3高表達(dá)與RC患者預(yù)后良好相關(guān)，該基因可能參與RC轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)等過(guò)程并發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

而針對(duì)NFE2L3在上述不同惡性腫瘤中既有發(fā)揮促癌基因的作用亦有抑癌基因的作用，甚至在大腸癌不同細(xì)胞株中扮演著相反的角色，這一現(xiàn)象也提示：NFE2L3在腫瘤中所發(fā)揮的調(diào)控作用存在著較大的異質(zhì)性，未來(lái)仍需要進(jìn)一步深入探索，剖析其在具體瘤種中的特異性作用及其分子機(jī)制。