朱 莉，官偉寧，杜丹丹，李 俊，左春林

格雷夫斯病(graves' disease，Graves病，GD)是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，臨床上針對GD有三種治療方法，即抗甲狀腺藥物，碘131(131I)及手術(shù)治療[1]。相比另兩種療法，131I治療有方便、經(jīng)濟(jì)、治愈率高的特點(diǎn)，但永久性甲狀腺功能減退癥(甲減)是其難以回避的副作用。針對引起甲減的相關(guān)因素，目前研究結(jié)果多不一致。Yang et al[2]提出其與甲狀腺24 h碘攝取量、治療時碘總劑量、游離甲狀腺素水平、甲狀腺質(zhì)量以及抗甲狀腺藥物的使用相關(guān)。filigoj et al[3]研究表明年齡是其獨(dú)立影響因素。子宮球蛋白相關(guān)蛋白1(uteroglobin-related protein 1，UGRP1)是一種功能尚未完全明確的分泌蛋白，在正常甲狀腺組織有少量表達(dá)[4]。UGRP1基因位于GD的易感區(qū)段內(nèi)，且是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子的下游靶基因，可能參與GD的發(fā)病過程[5]。該研究通過針吸GD患者甲狀腺細(xì)胞分析UGRP1的表達(dá)情況，觀察其與131I治療后發(fā)生早期甲減風(fēng)險的相關(guān)性，旨在探究GD患者131I治療后甲減發(fā)生風(fēng)險的預(yù)測指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 病例資料招募2017年3月～2018年3月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科首次接受131I治療女性GD住院患者共38例，所有患者符合放射碘治療指征[6]。每例患者在接受131I治療前均行甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查，留取切片兩張，分別行蘇木精-伊紅染色及UGRP1免疫組化染色。本研究通過安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組患者知悉檢測內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑一抗：兔抗人UGRP1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二抗：PV6000山羊抗兔IgG/HRP聚合物、DAB試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗步驟(Envision二步法)-20 ℃冰箱保存標(biāo)本，37 ℃烤箱孵育30 min，使用3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性及0.3% TRIton-X100溶解細(xì)胞膜和核膜的脂質(zhì)；滴加兔來源的UGRP1抗體(1 ∶500)覆蓋切片，4 ℃孵育過夜；滴加即用型二抗，37 ℃烤箱孵育30 min，滴加適量新鮮配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察控制顯色時間；蘇木精染液染色20 s，純水沖洗10 min充分藍(lán)化，自然風(fēng)干后，中性樹脂封片。

1.4 實(shí)驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)在光鏡下分析，排除非特異性染色前提下，細(xì)胞膜上或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有黃色、棕黃色或棕褐色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。本研究樣本均由兩名具備病理檢驗資質(zhì)的醫(yī)師進(jìn)行閱片。

2 結(jié)果

2.1 GD患者131I治療前的資料根據(jù)UGRP1的表達(dá)的情況，將38例患者分為UGRP1陽性表達(dá)組和UGRP1陰性表達(dá)組，131I治療前兩組GD患者的年齡、病程、血常規(guī)、肝功能、血清中三碘甲狀腺氨酸(triiodothyronine，TT3 )、甲狀腺素(thyroxine，TT4)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、抗甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibody，ATG)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)和促甲狀腺激素受體抗體(thyroid stimulating hormone receptor antibody，TRAb)等組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組治療前臨床資料的比較(n=38)

2.2 UGRP1在GD甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá)GD患者的甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)可見甲狀腺濾泡細(xì)胞片樣排列，周圍可見吸收空泡，部分核大，細(xì)胞質(zhì)較寬。背景可見膠質(zhì)，淋巴細(xì)胞少量。UGRP1抗原呈棕黃色或棕褐色，定位于甲狀腺濾泡細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。通過免疫組化的檢測，其中有20例患者甲狀腺細(xì)胞中UGRP1陽性表達(dá)，陽性率為52.6%，見圖1A、1B、1C；而18例患者甲狀腺細(xì)胞中UGRP1陰性表達(dá)，陰性率為47.4%，見圖1D、1E、1F。

圖1 UGRP1在GD甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá) IHC×200A、B、C：UGRP1陽性表達(dá)組；D、E、F：UGRP1陰性表達(dá)組

2.3 UGRP1陽性與陰性表達(dá)組的甲狀腺功能差異不干預(yù)治療過程，所有患者在行131I治療后12周隨訪甲狀腺功能，其中UGRP1陽性表達(dá)組的TT3與TT4水平均低于UGRP1陰性表達(dá)組，而TSH水平明顯高于UGRP1陰性表達(dá)組，兩組間TT3與TSH水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 131I治療后12周兩組間甲狀腺功能的比較(n=38)

2.4 GD患者131I治療甲減發(fā)生預(yù)測因素分析本研究中，對GD患者131I治療后出現(xiàn)甲減的臨床及檢驗因素進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在眾多因素中，UGRP1陽性表達(dá)與否同GD患者131I治療后甲減的發(fā)生顯著相關(guān)，在UGRP1陽性的患者中，發(fā)生甲減的概率顯著增加(P<0.01)。見表3。

3 討論

131I治療GD患者的主要并發(fā)癥是甲狀腺功能減退。目前的研究顯示，絕大多數(shù)患者131I治療后發(fā)生早期甲減，通常發(fā)生在131I治療后的前3～6個月內(nèi)[7]，若診斷不及時或未及時給予甲狀腺激素替代治療，可能會導(dǎo)致甲減加重，甚至需永久性使用甲狀腺激素改善機(jī)體情況，因此早期識別甲減的發(fā)生概率對指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。

表3 131I治療后12周各組間甲減發(fā)生情況的比較[n(%)]

UGRP1基因區(qū)域已被證實(shí)含哮喘易感位點(diǎn)及編碼多種輔助性T細(xì)胞2型細(xì)胞因子，具有潛在的抗炎作用[8]。2009年Song et al[5]利用TagSNP技術(shù)，采用定位克隆策略，率先識別出UGRP1基因為GD的易感基因之一。但到目前為止，UGRP1如何促進(jìn)甲亢的發(fā)生尚不清楚。研究[9]顯示，UGRP1基因敲除小鼠接受卵清蛋白誘導(dǎo)時，表現(xiàn)出加重的肺部炎癥。另外，UGRP1可能通過調(diào)節(jié)胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子17和趨化因子受體4途徑發(fā)揮抗炎活性[10]。早期研究[11-13]表明，UGRP1可能通過激活或抑制某些細(xì)胞因子的活性而發(fā)揮抗炎作用，如白介素-5(interleukin-5，IL-5)、IL-9、IL-10等。

本研究結(jié)果顯示，在UGRP1陽性的GD患者中，131I治療后甲減的發(fā)生率為75%，在UGRP1陰性的GD患者中，131I治療后甲減的發(fā)生率為33%，UGRP1與GD患者131I治療后甲減發(fā)生顯著相關(guān)，且治療前兩組患者的年齡，身高，體質(zhì)量，病程，抗甲狀腺藥物治療時間，血常規(guī)，肝功能，甲狀腺激素及抗體水平等因素均無明顯差異。另外本研究僅顯示UGRP1與GD患者131I治療后甲減發(fā)生率相關(guān)，而患者的年齡，體質(zhì)量指數(shù)，病程，抗甲狀腺藥物治療時間，白細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶，TPOAb，ATG，Tg，TRAb等因素均與甲減發(fā)生無關(guān)，因此無其他因素共同納入進(jìn)行下一步多因素回歸分析。本研究為首次在GD患者臨床樣本中檢測UGRP1表達(dá)，并探究UGRP1蛋白表達(dá)水平及其它臨床因素與131I治療后甲減發(fā)生的相關(guān)性，結(jié)果表明UGRP1對于GD患者行131I治療后發(fā)生甲減的概率可能有預(yù)測作用。根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，推測UGRP1可能本身是一個抗炎因子，或可能為炎癥反應(yīng)過程中的重要調(diào)節(jié)因子，從而參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，影響GD的致病過程及轉(zhuǎn)歸。UGRP1抑制炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制，影響GD致病過程及轉(zhuǎn)歸的具體途徑，是否還有其他的受體尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，本研究表明GD患者行131I治療后發(fā)生甲減可能與UGRP1在甲狀腺細(xì)胞中的高表達(dá)有關(guān)，UGRP1高表達(dá)是否作為GD患者131I治療后甲減發(fā)生的有效預(yù)測因子，將有賴于多中心、大樣本的臨床研究。同時本研究為GD患者選擇合適的治療方式，在提高其治愈率同時盡可能降低甲減的發(fā)生率提供了一條新思路。