馬 玉 ，楊雯雯，范 哲，吳永貴，夏玲玲

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最嚴(yán)重和最常見的并發(fā)癥之一。腎小球肥大、基底膜增厚和多種細(xì)胞外基質(zhì)沉積是DN的病理學(xué)基礎(chǔ)，最終導(dǎo)致腎小球和腎間質(zhì)纖維化[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞(mesangial cells, MCs)中核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)在DN炎癥及纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可激活其下游Smad3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原(collagenⅣ，Col Ⅳ)和纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)分泌增加，導(dǎo)致腎臟纖維化[4-5]。褪黑素(melatonin, MT)是由松果體產(chǎn)生的吲哚，具有抗氧化和抗炎的特性。研究[6]顯示MT可以抑制腎臟炎癥發(fā)揮腎臟保護(hù)作用；另有研究[7]證實(shí)MT通過抑制NF-κB信號通路從而降低炎癥的產(chǎn)生。該研究旨在探討在MCs中MT是否通過NF-κB及TGF-β/Smad3通路抑制纖維化因子的產(chǎn)生，為DN的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料MCs SV40 MES13細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；MT、甘露醇、高糖購自美國sigma公司；DMEM1.0培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液購自美國Thermo Scientific公司；BCA蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物工程研究所；CCK-8試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；小鼠Col Ⅳ和Fn 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物科技有限公司；兔抗NF-κBp65單克隆抗體、鼠抗核因子κB抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)單克隆抗體、鼠抗p-IκB單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，兔抗Smad3多克隆抗體和兔抗p-Smad3多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗Col Ⅳ多克隆抗體、兔抗Fn多克隆抗體和小鼠抗β-actin單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將液氮中凍存的系膜細(xì)胞取出，在37 ℃的水浴鍋中迅速融化，轉(zhuǎn)移至10 ml的離心管中，加5～6 ml培養(yǎng)液吹打混勻，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加5 ml培養(yǎng)液吹打重懸后，接種至含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM1.0的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為：甘露醇對照組，正常對照組(糖濃度為5 mmol/L)，正常對照+MT組，高糖組(糖濃度為25 mmol/L)，高糖+10 μmol/L MT組，高糖+100 μmol/L MT組，高糖+1 000 μmol/L MT組。

1.2.3CCK-8檢測細(xì)胞活性 將濃度為1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔加入100 μl，無細(xì)胞組和空白對照組加單純培養(yǎng)基100 μl，37 ℃培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同刺激藥物，培養(yǎng)基其它成分與正常對照組相同，培養(yǎng)24 h后，按照CCK-8試劑盒說明書檢測系膜細(xì)胞活性情況。

1.2.45-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)檢測細(xì)胞增殖 將濃度為1×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)。按照實(shí)驗(yàn)分組加藥刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入2×EdU 工作液，孵育30 min，棄去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛細(xì)胞固定液，孵育15 min,棄去細(xì)胞固定液，含 3% BSA 的 PBS漂洗2次，加入PBST，室溫孵育 20 min，每孔加入100 μl iClick 反應(yīng)液，避光，室溫孵育30 min, 1 × Hoechst 33342 染色液避光染色15 min，封片，激光共聚焦顯微鏡(LSM880，購自德國卡爾蔡司)拍照觀察。

1.2.5激光共聚焦檢測NF-κBp65核轉(zhuǎn)移及Col Ⅳ和Fn的表達(dá) 將適宜濃度的細(xì)胞懸液加入裝有蓋玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。按照實(shí)驗(yàn)分組每組加入不同刺激物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定5 min，0.5% TRItonx-100孵育15 min，5%驢血清4 ℃封閉2 h，加入兔抗NF-κBp65、兔抗Col Ⅳ及兔抗Fn的一抗4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3遍，每遍5 min，然后加入熒光二抗，常溫避光孵育2 h，DAPI染液染核10 min，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察采像。

1.2.6ELISA檢測細(xì)胞因子表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞上清液，按照各ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7qRT-PCR檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取各組細(xì)胞mRNA,加入4 μl 5 × HiScript Ⅱ qRT SuperMix、1 μg模板RNA、RNase free ddH2O配制成20 μl混合液，逆轉(zhuǎn)錄條件第一步50 ℃、 15 min，第二步8 ℃、5 s，合成cDNA。按SYBR Green PCR試劑盒檢測Col Ⅳ和Fn mRNA表達(dá)，引物序列見表1。加入10 μl 2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、0.4 μl Primer1(10 μmol/L)、0.4 μl Primer2(10 μmol/L )、0.4 μl 50×ROX Reference Dye 2、2 μl DNA模板、ddH2O配制成20 μl混合液，按第一步95 ℃、5 min，1個(gè)循環(huán)；第二步95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；第三步95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，1個(gè)循環(huán)的條件進(jìn)行反應(yīng)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計(jì)算。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.2.8Western blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加上樣緩沖液煮沸10 min后，取40 μg蛋白上樣，經(jīng)8%～12%SDS-PAGE凝膠電泳，濕電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，麗春紅顯色，5%脫脂牛奶-PBST溶液4 ℃封閉2 h，分別加入Col Ⅳ(1 ∶500)、Fn(1 ∶1 000)、TGF-β1(1 ∶1 000)、Smad3(1 ∶1 000)、p-Smad3(1 ∶1 000)、IκB(1 ∶1 000)、p-IκB(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶35 000)，4 ℃過夜，PBST洗3次，每次10 min，加入對應(yīng)二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育45 min，洗膜，顯影。采用β-actin作為內(nèi)參，系統(tǒng)軟件Image-J進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測各組MCs活性與正常對照組相比，高糖組、高糖+1 μmol/L MT組、高糖+10 μmol/L MT組、高糖+100 μmol/L MT組、高糖+1 000 μmol/L MT組MCs活性未受影響(P>0.05)；高糖+10 000 μmol/L MT組MCs的活性降低(F=53.010，P<0.05)。見圖1。

2.2 EdU檢測各組MCs增殖情況及激光共聚焦檢測NF-κBp65亞基入核在MCs增殖檢測中，與正常對照組比較，甘露醇對照組和正常對照+MT組的紅色熒光表達(dá)無差異，高糖組紅色熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)；與高糖組相比，高糖+10 μmol/L MT組、高糖+100 μmol/L MT組、高糖+1 000 μmol/L MT組紅色熒光強(qiáng)度均下降，其中MT干預(yù)組的熒光下降程度與MT濃度呈正相關(guān)。在NF-κBp65入核檢測中，與正常對照組相比，高糖組NF-κBp65的綠色熒光顯著增強(qiáng)，且入核明顯增多；與高糖組比較，高糖+10 μmol/LMT組、高糖+100 μmol/L MT組、高糖+1 000 μmol/L MT組NF-κBp65綠色熒光強(qiáng)度及入核均呈濃度依賴性降低。見圖2。

圖1 MT對高糖刺激MCs活性的影響

A：正常對照組；B：高糖組；C：高糖+1 μmol/L MT組；D：高糖+10 μmol/L MT組；E：高糖+100 μmol/L MT組；F：高糖+1 000 μmol/L MT組；G：高糖+10 000 μmol/L MT組；與正常對照組比較：*P<0.05

圖2 共聚焦顯微鏡下各組MCs 增殖及

A：甘露醇對照組；B：正常對照組；C：正常對照+MT組；D：高糖組；E：高糖+10 μmol/L MT組；F：高糖+100 μmol/L MT組；G：高糖+1 000 μmol/L MT組

2.3 激光共聚焦檢測各組MCs Col Ⅳ、Fn的表達(dá)與正常對照組比較，甘露醇對照組和正常對照+MT組Col Ⅳ 綠色熒光、Fn紅色熒光強(qiáng)度無差異，高糖組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與高糖組相比，高糖+10 μmol/L MT組、高糖+100 μmol/L MT組、高糖+1 000 μmol/L MT組的熒光強(qiáng)度均下降，其中MT干預(yù)組的熒光下降程度與MT濃度呈正相關(guān)。見圖3。

圖3 共聚焦顯微鏡下各組MCs Col Ⅳ、Fn表達(dá)情況 ×630

A：甘露醇對照組；B：正常對照組；C：正常對照+MT組；D：高糖組；E：高糖+10 μmol/L MT組；F：高糖+100 μmol/L MT組；G：高糖+1 000 μmol/L MT組

2.4 ELISA檢測各組MCs上清液中Col Ⅳ、Fn表達(dá)水平與正常對照組比較，甘露醇對照組和正常對照+MT組收取的培養(yǎng)基上清液中所含Col Ⅳ和Fn水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高糖組纖維化因子Col Ⅳ和Fn水平明顯上升(P<0.05)；與高糖組相比，高糖+10 μmol/L MT組Col Ⅳ水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高糖+100 μmol/L MT組、高糖+1 000 μmol/L MT組Col Ⅳ水平均明顯降低，其降低程度與MT濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組相比，高糖+10 μmol/L MT組、高糖+100 μmol/L MT組、高糖+1 000 μmol/L MT組Fn水平均顯著下降，其降低程度與MT濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCol Ⅳ= 60.438，F(xiàn)Fn=2 074.666，P<0.05)。見表2。

2.5 qRT-PCR檢測各組MCs Col Ⅳ和Fn mRNA表達(dá)變化與正常對照組比較，甘露醇對照組和正常對照+MT組Col Ⅳ和Fn mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高糖組Col Ⅳ和Fn mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與高糖組相比，高糖+10 μmol/L MT

表2 各組上清液中Col Ⅳ、Fn含量

A：甘露醇對照組；B：正常對照組；C：正常對照+MT組；D：高糖組；E：高糖+10 μmol/L MT組；F：高糖+100 μmol/L MT組；G：高糖+1 000 μmol/L MT組；與正常對照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05

組、高糖+100 μmol/L MT組、高糖+1 000 μmol/L MT組mRNA轉(zhuǎn)錄均明顯降低，其降低程度與MT濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCol Ⅳ=61.011，F(xiàn)Fn=16.287，P<0.05)。見圖4。

圖4 qRT-PCR檢測各組MCs Col Ⅳ、Fn mRNA表達(dá)

A：甘露醇對照組；B：正常對照組；C：正常對照+MT組；D：高糖組；E：高糖+10 μmol/L MT組；F：高糖+100 μmol/L MT組；G：高糖+1 000 μmol/L MT組；與正常對照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05

2.6 Western blot檢測各組MCs Col Ⅳ、Fn、p-IκB/IκB、TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)與正常對照組比較，甘露醇對照組和正常對照+MT組Col Ⅳ、Fn、p-IκB/IκB、TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高糖組各蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)；高糖+10 μmol/L MT組、高糖+100 μmol/L MT組、高糖+1 000 μmol/L MT組各蛋白表達(dá)與高糖組相比均降低，其降低程度與MT濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCol Ⅳ=231.419，F(xiàn)Fn=403.166，F(xiàn)p-IκB/IκB=785.722，F(xiàn)TGF-β1=107.384，F(xiàn)p-Smad3/Smad3=178.465，P<0.05)。見圖5、6、7。

3 討論

DN是糖尿病患者死亡的主要原因，它是一種原發(fā)性慢性微血管病變，微炎癥和隨后的細(xì)胞外基質(zhì)增加是DN進(jìn)展的主要途徑[5, 8]。MCs作為腎臟重要組成細(xì)胞之一，具有收縮、吞噬、增殖、合成系膜基質(zhì)和膠原的功能。高血糖是DN發(fā)生的啟動因素，越來越多的研究[3, 9]表明，高糖刺激可以誘導(dǎo)MCs分泌Col Ⅳ和Fn增加，引起腎臟纖維化。本實(shí)驗(yàn)采用高糖刺激MCs，模擬糖尿病高糖微環(huán)境，結(jié)果顯示，與正常糖濃度對照組相比，高糖組MCs增殖明顯上調(diào)，促纖維化細(xì)胞因子 TGF-β1及細(xì)胞外基質(zhì)Col Ⅳ和Fn表達(dá)明顯增強(qiáng)。

圖5 Western blot檢測各組MCs Col Ⅳ、Fn 蛋白表達(dá)

A：甘露醇對照組；B：正常對照組；C：正常對照+MT組；D：高糖組；E：高糖+10 μmol/L MT組；F：高糖+100 μmol/L MT組；G：高糖+1 000 μmol/L MT組；與正常對照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05

圖6 Western blot檢測各組MCs p-IκB/IκB蛋白表達(dá)

A：甘露醇對照組；B：正常對照組；C：正常對照+MT組；D：高糖組；E：高糖+10 μmol/L MT組；F：高糖+100 μmol/L MT組；G：高糖+1 000 μmol/L MT組；與正常對照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05

圖7 Western blot檢測各組MCs TGF-β1、

A：甘露醇對照組；B：正常對照組；C：正常對照+MT組；D：高糖組；E：高糖+10 μmol/L MT組；F：高糖+100 μmol/L MT組；G：高糖+1 000 μmol/L MT組；與正常對照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05

NF-κB在炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。未受刺激時(shí)，NF-κB游離存在胞質(zhì)中，一旦受到刺激，NF-κB 便移位于細(xì)胞核中并促進(jìn)多種炎癥因子如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素1β和單核細(xì)胞趨化因子1的釋放,并且促進(jìn)促纖維化因子TGF-β1的產(chǎn)生[2,10]。TGF-β/Smad3信號通路是參與膠原產(chǎn)生的關(guān)鍵信號通路之一，促纖維化因子TGF-β1的激活以及細(xì)胞外基質(zhì)Col Ⅳ和Fn的產(chǎn)生，導(dǎo)致腎小球系膜基質(zhì)積聚，腎小管間質(zhì)硬化[11]。既往研究[4, 12]顯示，抑制TGF-β/Smad3信號通路可以預(yù)防腎纖維化。在本實(shí)驗(yàn)中，通過激光共聚焦顯微鏡觀察到，高糖組的NF-κBp65熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，入核明顯增加；Western bolt顯示p-IκB/IκB蛋白表達(dá)顯著升高，TGF-β1和p-Smad3/Smad3的蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)?？梢酝茰y出高糖刺激可以增強(qiáng)NF-κBp65入核，并且激活TGF-β/Smad3信號通路使MCs外基質(zhì)Col Ⅳ和Fn的分泌明顯增加。

MT主要由松果體產(chǎn)生，前期研究[13-14]顯示MT具有抗氧化，抗炎和抗細(xì)胞凋亡等多種藥理活性。近期研究[14]表明MT對DN具有保護(hù)作用，但具體的保護(hù)機(jī)制仍是不明確的。本實(shí)驗(yàn)采用高糖模擬糖尿病微環(huán)境，刺激MCs，觀察到MT對高糖刺激的MCs的增殖起到抑制作用，抑制 NF-κBp65入核，減少促纖維化因子TGF-β1、細(xì)胞外基質(zhì)Col Ⅳ和Fn的合成分泌，這些證實(shí)了MT具有抗纖維化作用；同時(shí)觀察到MT對正常糖濃度下MCs的增殖、NF-κBp65入核、TGF-β/Smad3信號通路及Col Ⅳ和Fn的分泌無影響，由此可以推測MT是通過抑制高糖刺激下NF-κBp65入核及TGF-β/Smad3信號通路上調(diào)抑制MCs分泌Col Ⅳ和Fn。

綜上所述，高糖刺激可以導(dǎo)致MCs增殖，并且誘導(dǎo)MCs的NF-κBp65入核及TGF-β/Smad3信號通路激活，從而促進(jìn)Col Ⅳ和Fn的分泌；MT可以抑制高糖誘導(dǎo)的MCs增殖，并且通過干預(yù)MCs 的NF-κBp65核轉(zhuǎn)位及TGF-β/Smad3信號通路上調(diào)從而降低高糖引起的Col Ⅳ和Fn的分泌。本研究參考了大量國內(nèi)外文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)系膜的增生及Col Ⅳ和Fn的分泌可引起糖尿病腎病腎臟的纖維化，但機(jī)制尚未闡明，此研究深入探討了相關(guān)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)MCs增殖及外基質(zhì)的分泌可能與NF-κB及TGF-β/Smad3通路相關(guān)，MT可通過抑制NF-κB及TGF-β/Smad3信號通路從而減弱高糖刺激下MCs的增殖及外基質(zhì)的分泌，為DN腎臟纖維化提供了新的思路與視角，但此作用是否同時(shí)與其他信號通路有關(guān)還需深入研究。