陳相東，張 沖，鄧志權(quán)，徐正猛，樓一層

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

失眠是一種世界范圍內(nèi)的普遍問題，據(jù)統(tǒng)計(jì)世界各國均存在較多失眠癥患者。在這些國家當(dāng)中巴西、美國、英國、法國等國人口的失眠發(fā)病率較高，均在30%以上，其中巴西更是達(dá)到40%。我國患失眠癥的比例僅為25%，但是由于我國人口基數(shù)高，患病人數(shù)高達(dá)4億人，患病人數(shù)排在世界前列[1-3]。

復(fù)方纈草方是湖北省中醫(yī)院用于治療失眠的經(jīng)驗(yàn)方，已有多年的臨床應(yīng)用歷史。處方由纈草(ValerianaofficinalisL.)、夏枯草(Subtrib.BrunellinaeBriq)、棗仁(SemenZiziphiSpinosae)、茯神(SclerotiumPoriaeCircumRadicemPini)、半夏(RhizomaPinelliae)、燈心草(MedullaJunci)、炒梔子(FructusGardeniae)等多味中藥組成，具有補(bǔ)心養(yǎng)肝、養(yǎng)血安神的作用，常用于治療心肝血虛引起的頭暈、心煩、失眠等癥[1]，有著不錯的效果。但在制備工藝上有些粗糙，還有許多值得改進(jìn)的地方。本研究擬采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化復(fù)方纈草膠囊的制備工藝，使制得的膠囊藥效高，穩(wěn)定性更好，為后續(xù)可能的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

FA-1004型分析天平(METTLER TOLEDO公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)式蒸(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)；DHJF-2014型冷凝泵(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)；SHB-Ⅲ型真空泵(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)；HB-2型電子控溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)；KQ-310DE型數(shù)字超聲清洗器(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)；GZX-3型真空干燥箱(德國Memmert公司)；HWZ-10B型微波真空干燥箱(德國Memmert公司)；1220型液相色譜儀(美國Agilent公司)；AJC-0501-P型純水儀(美國艾科浦)。

乙腈(Aladdin科技有限公司，色譜純)；乙酸乙酯(Aladdin科技有限公司，色譜純)；甲醇(Aladdin科技有限公司，分析純)；乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品(Aladdin科技有限公司，批號21060328)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油部位的提取

稱取100 g纈草藥材粉碎成細(xì)粉放入加有足量沸石的反應(yīng)器中，然后倒入藥材重量8倍的純化水，振搖攪拌至藥粉完全浸泡于水中，充分吸水后靜置30 min待用。此時將反應(yīng)裝置搭好，向提取裝置中滴入純化水直至液面到達(dá)0刻度線，斜管處剛好溢流少量純化水至燒瓶為止。靜置結(jié)束后開啟加熱裝置讓體系達(dá)到沸騰狀態(tài)，保持其沸騰狀態(tài)適度，當(dāng)15 min內(nèi)揮發(fā)油液面所在刻度無明顯變化時停止加熱，靜置5 min后打開旋塞讓水緩慢滴出，當(dāng)揮發(fā)油層液面上端接近0刻度線時關(guān)閉活塞，靜置1 h。打開旋塞至油層上端與0刻度線在同一水平線上，其下液面所對刻度即為總提取量。用無水Na2SO4對制得的揮發(fā)油進(jìn)行干燥，濾出后密封放置于棕色干燥器保存?zhèn)溆肹4-7]。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，本部分?jǐn)M選用浸泡時間A、液料比B和提取時間C為考察因素(見表1)，以乙酸龍腦酯提取率(mg·g-1)為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)型實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究(見表2)，同時按表1在不同實(shí)驗(yàn)條件對纈草揮發(fā)油進(jìn)行提取，將得到的復(fù)方纈草膠囊揮發(fā)油部位進(jìn)行氣相色譜檢測，并通過與乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比和綜合分析計(jì)算乙酸龍腦酯提取率(mg·g-1)，通過數(shù)據(jù)分析與比較最終確定實(shí)驗(yàn)水平下的最優(yōu)生產(chǎn)條件[8-10]。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平因素

表2 各組正交實(shí)驗(yàn)條件

其中：Y為提取率；Cba為乙酸龍腦酯濃度；X為揮發(fā)油提取量；n為藥材總量。

2.3 乙酸龍腦酯的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱Agilent 19091J-413，30.0 μm×320 m×0.25 m彈性石英毛細(xì)管柱，最高溫度為325 ℃；檢測器：氫焰分析器；載氣為氮?dú)饧兌?9.99%，壓力為0.1 MPa，尾吹0.05 MPa，流速為1.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；汽化室溫：280 ℃，色譜柱溫度：初始溫度50 ℃平衡3 min，之后以8 ℃·min-1升溫速度加溫至100 ℃。再以17 ℃·min-1速度升溫直到加溫至不再有信號被檢測到(不得超過250 ℃機(jī)器上限)。以此方法對制好的對照品與供試品進(jìn)行檢測，經(jīng)分析計(jì)算揮發(fā)油部位乙酸龍腦酯的含量。

2.3.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：取精密稱定后的乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品加至乙酸乙酯中溶解，定容后得到濃度為0.1 g·mL-1的體系作為母液按實(shí)驗(yàn)需求配制對照品。供試品溶液的制備：取纈草藥材100 g每組，經(jīng)上述方法進(jìn)行揮發(fā)油提取，取得到的揮發(fā)油0.6 g加入5 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯搖勻后定容至5 mL。得到的供試品溶液應(yīng)嚴(yán)格密封保存至干燥器中，在使用前應(yīng)用0.22μm濾膜過濾后再進(jìn)行檢測。

2.3.3 專屬性考察 精密吸取對照品，供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下測定，結(jié)果見圖1，在相同保留時間上均有對應(yīng)峰(即乙酸龍腦酯)，可知其他成分對測定結(jié)果沒有影響。

2.3.4 線性關(guān)系考察 將上述待用母液按需求分別進(jìn)行定量稀釋，制成濃度為0.02 g·mL-1、0.04 g·mL-1、0.06 g·mL-1、0.08 g·mL-1、0.10 g·mL-1的對照組溶液。用注射器分別取上述各組溶液用0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，各濃度組依次取1 μL作為對照品加至氣相色譜中按上述測試方法進(jìn)行測試，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。通過統(tǒng)計(jì)與回歸分析得到回歸方程為：y=5141923.35x+ 2889.55，R2=0.9998，其中X為濃度值，Y為峰面積。標(biāo)準(zhǔn)品GC圖如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。上述結(jié)果表明當(dāng)對照組濃度為0.02～0.10 g·mL-1范圍內(nèi)時，溶液濃度與各組峰積分面積呈現(xiàn)出線性關(guān)系，可以用此方程進(jìn)行分析計(jì)算。

圖1 乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品和供試品GC圖譜

表3 對照組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖2 對照組標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 依照實(shí)驗(yàn)組5因素水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與后續(xù)制備，制備產(chǎn)物重復(fù)檢測6次。各組實(shí)驗(yàn)乙酸龍腦酯提取率檢測數(shù)據(jù)如表4所示，6組實(shí)驗(yàn)提取率RSD為0.384%，證明此測定方法有著非常好的精密度。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取實(shí)驗(yàn)組5樣品于第0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h時依次檢測，計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)乙酸龍腦酯提取率(表5)。經(jīng)計(jì)算提取率RSD為1.721%，表明本方法穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下的方法對同一批樣品提取揮發(fā)油共6次，將所得揮發(fā)油依次配制為供試品溶液并按上述檢測方法進(jìn)行檢測，計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)乙酸龍腦酯提取率(表6)。應(yīng)用本法提取率RSD為1.326%，證明本檢測方法可以非常好地被重復(fù)，可以作為一種標(biāo)準(zhǔn)測試手段。

表6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取六組相同體積樣品，各含0.053 0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，依次加入0.02 mg、0.02 mg、0.04 mg、0.04 mg、0.05 mg、0.05 mg乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品，超聲處理使其完全溶解。按上述檢測方法進(jìn)行檢測，根據(jù)乙酸龍腦酯含量計(jì)算各組加樣后的總回收率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表7所示。數(shù)據(jù)顯示各組實(shí)驗(yàn)回收率均趨近于100%水平，RSD值為1.622%，表明本法作為一種含量測定方法具有非常好的準(zhǔn)確性，在標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)回收率滿足要求。

表7 加樣回收實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4 正交試驗(yàn)

取各實(shí)驗(yàn)組供試樣品2 μL依次按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析見表8、表9。

表8 直觀分析數(shù)據(jù)

表9 方差分析數(shù)據(jù)

根據(jù)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知：各因素R值分別為：0.254、1.560、7.747，RC>RB>RA，故各因素對提取率影響程度的重要性為C>B>A。根據(jù)表9中方差分析結(jié)果F值情況，可知因素C具有顯著性，而因素B的F值遠(yuǎn)大于A，但它們都不具有顯著性。提取率為正向優(yōu)勢數(shù)據(jù)，因此同一因素中k值大代表?xiàng)l件為優(yōu)。經(jīng)過上述分析A2B2C3為最佳條件。由于條件A即浸泡時間對提取率沒有顯著性影響且各組條件下數(shù)據(jù)差別不大，從減少實(shí)驗(yàn)所用時間的角度來講，應(yīng)選擇浸泡過程較短的0.5 h做為工藝的最優(yōu)浸泡條件。條件B的改變也對實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有顯著影響，但當(dāng)液料比為10∶1時，其K值相較于8∶1與12∶1均更高，與此同時考慮到對藥材更好浸泡等因素最終選擇最優(yōu)的B2條件即10∶1作為最優(yōu)的液料比。實(shí)驗(yàn)條件C，即提取時間對提取率有顯著性影響且隨提取時間增長提取率也在增長，故選擇C3條件即提取5 h作為最優(yōu)的揮發(fā)油提取工藝。最終確定以10倍量的純化水加至藥材中，浸泡0.5 h后進(jìn)行揮發(fā)油提取，總共提取5 h后收集提取到的揮發(fā)油成分并儲存?zhèn)溆谩Ｓ捎谧罱K確定的工藝條件與上面提到的A2B2C3條件并不相同，因此決定以兩種條件分別各進(jìn)行三組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，考察其是否具有較大的差異性，同時驗(yàn)證工藝的可行性。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為測試上述正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的A1B2C3條件是否具有重復(fù)性與穩(wěn)定性，和是否與A2B2C3條件有較大差異，擬分別選用兩種條件按照“2.1”項(xiàng)下?lián)]發(fā)油提取工藝進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)各3組，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示，提取按照條件A1B2C3工藝進(jìn)行提取與條件A2B2C3進(jìn)行提取乙酸龍腦酯提取率基本一致，差異較小，且RSD為1.064%符合標(biāo)準(zhǔn)，表明本實(shí)驗(yàn)方案合理且穩(wěn)定可行。故最終確定以“將藥材細(xì)粉加至放有足量沸石的反應(yīng)器。之后倒入藥材重量10倍的純化水，振搖攪拌至藥粉完全浸泡于水中充分吸水后靜置30 min待用。開啟加熱裝置讓體系達(dá)到沸騰狀態(tài)，保持適度沸騰5 h”作為制備處方揮發(fā)油部位的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案。

3 討論

揮發(fā)油提取技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)較為成熟，在這些方法當(dāng)中水蒸氣蒸餾法歷史悠久、操作簡單高效是最常見的一種技術(shù)。諸如萃取法和冷壓法等也在其各自優(yōu)勢的領(lǐng)域發(fā)揮良好的提取效果。在實(shí)驗(yàn)前期通過對方法操作難易程度、需要提取量與現(xiàn)有設(shè)備可行性等方面進(jìn)行綜合考量，最終選擇使用水蒸氣蒸餾法對纈草進(jìn)行提取。水蒸氣蒸餾法的應(yīng)用最為廣泛，方法成熟度較高，相對于溶劑萃取法、冷壓法等方法適應(yīng)性更廣、可行性較高。而通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)纈草揮發(fā)油可穩(wěn)定與水分層且浮于水層之上，證明纈草揮發(fā)油密度小于水的密度，可以應(yīng)用2015版《中國藥典》第四部通則2204項(xiàng)下甲法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

從上述分析可以看出，各因素對提取率影響程度的重要性依次為C>B>A。且因素A的顯著性最弱，通過正交實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)方案為A2B2C3，但考慮到之后中試實(shí)驗(yàn)放大帶來的影響可能會增加浸泡時間，因此在可能的前提下應(yīng)盡可能減少浸泡時間，使得整體生產(chǎn)工藝更效率化、經(jīng)濟(jì)化。通過對A1B2C3和A2B2C3的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)比較，乙酸龍腦酯的提取率幾乎沒有影響，且RSD值均符合標(biāo)準(zhǔn)，因此最終確定的最佳提取工藝為A1B2C3，即“將藥材細(xì)粉加至放有足量沸石的反應(yīng)器。之后倒入藥材重量10倍的純化水，振搖攪拌至藥粉完全浸泡于水中充分吸水后靜置30 min待用。開啟加熱裝置讓體系達(dá)到沸騰狀態(tài)，保持適度沸騰5 h”，這對于之后的中試生產(chǎn)有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。