鄭繼標(biāo)，楊紅梅，黃春華，陳柳葵，聶娟

(1.湛江中心人民醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 湛江 524000；2.澳門大學(xué) 健康科學(xué)學(xué)院，澳門999078；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 511400)

野菊花為菊科植物野菊(ChrysanthemumindicumL.)的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、瀉火平肝之功效，臨床用于目赤腫痛、臃腫疔瘡、頭痛眩暈的治療[1]。野菊花為野菊花栓、復(fù)方野菊花降壓顆粒等中藥制劑的主要原料。其資源豐富，分布于吉林、遼寧、湖北、廣西等我國(guó)大部分地區(qū)。野菊花含有黃酮類、萜類、多糖等多種化學(xué)成分[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，野菊花具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤、降壓、保肝等藥理作用[3]。

作為藥食兩用的植物，野菊花在藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域具有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。最新版藥典記載入藥的主要部位為野菊花的頭狀花序，而實(shí)際上野菊花的其他部位在古籍與現(xiàn)實(shí)生活中也被證實(shí)具有較高的藥用價(jià)值。蒙花苷是野菊花含量較高的重要化學(xué)成分之一，但關(guān)于野菊花的花、莖、葉部位的蒙花苷含量測(cè)定及HPLC指紋圖譜比較還未曾見(jiàn)報(bào)道。因此本研究對(duì)野菊花的花、莖、葉中的蒙花苷含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)嘗試建立三個(gè)部位的HPLC指紋圖譜，以期為野菊花不同部位的資源開(kāi)發(fā)與臨床利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀(LC solution-20A)；萬(wàn)分之一電子分析天平(XB120A型，Precisa公司)；十萬(wàn)分之一電子分析天平(CP225D型，德國(guó)Sartorius公司)；電熱恒溫振蕩水槽(DKZ系列，上海一恒科技有限公司)；超純水系統(tǒng)(密理博-明澈-D-24UV，德國(guó)默克股份有限公司)。

1.2 試藥

乙腈、甲醇(德國(guó)默克股份有限公司)；磷酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；雙蒸水；蒙花苷(批號(hào)：480-36-4)、木犀草苷(批號(hào)：5373-11-5)、木犀草素(批號(hào)：491-70-3)、綠原酸(批號(hào)：327-97-9)、芹菜素(批號(hào)：520-36-5)對(duì)照品均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，野菊花花蕾、莖、葉經(jīng)湛江中心人民醫(yī)院藥學(xué)部鑒定為正品。

2 方法

2.1 蒙花苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為L(zhǎng)una 5u C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(26∶23∶1)，檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm。理論塔板數(shù)按蒙花苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000[1]。

2.1.2 溶液制備 (1)對(duì)照品溶液制備。精密稱取蒙花苷、綠原酸、木犀草素、木犀草苷、芹菜素五種對(duì)照品各1 mg，溶于4 mL甲醇，配制成0. 25 mg/mL的對(duì)照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)即可。

(2)供試品溶液配制。取野菊花花蕾、莖和葉粉末各0.5 g，精密稱定，置于250 mL圓底燒瓶中，加甲醇100 mL，密塞，稱定重量后回流提取2 h，放至室溫后稱重，加甲醇補(bǔ)足重量，搖勻， 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后即可使用。

2.1.3 方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察。分別精密吸取蒙花苷對(duì)照品溶液2、6、10、14、20 μL進(jìn)樣測(cè)定。以蒙花苷含量(x)為橫坐標(biāo)，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程為A=348124x-532757，r=0.998 6。表明蒙花苷在0.25～5 mg/mL濃度范圍內(nèi)與其峰面積積分線性關(guān)系良好。

(2)精密度試驗(yàn)。精密吸取蒙花苷對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到色譜圖，計(jì)算峰面積，結(jié)果表明蒙花苷峰面積RSD為0.60%，表明儀器精密度良好。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取野菊花花蕾藥材6份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，得到色譜圖，計(jì)算各個(gè)樣品中蒙花苷的峰面積，結(jié)果表明RSD為0.91%，說(shuō)明該方法重復(fù)性較好。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密稱取野菊花花蕾供試品溶液，分別于放置0、4、8、12、16、24 h后進(jìn)樣10 μL測(cè)定。結(jié)果表明蒙花苷峰面積RSD值為1.16%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

(5)加樣回收率。取已知蒙花苷含量的樣品(蒙花苷含量為0.712%)6份，每份約0.25 g， 加入一定量的蒙花苷對(duì)照品，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蒙花苷的加樣回收率

2.1.4 含量測(cè)定 精密稱取野菊花花蕾、莖、葉藥材粉末0.5 g，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定其含量。

2.2 野菊花不同部位HPLC指紋圖譜的建立

取野菊花的花蕾、莖、葉，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Luna 5u C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脫程序見(jiàn)表2[4]，柱溫：25 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件 (%)

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)確定 在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描供試品溶液，結(jié)果表明，供試品在290、320、360 nm處有較大吸收。在360 nm處，出峰數(shù)目較多，豐度降低，各個(gè)峰的保留時(shí)間適中，分離度較好，且基線穩(wěn)定，因此選擇360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.3 方法學(xué)考察 (1)精密度試驗(yàn)。取供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，以蒙花苷為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.66%，相對(duì)峰面積RSD均<1.23%，表明儀器的精密度較好，符合指紋圖譜測(cè)定的要求。

(2)重復(fù)性試驗(yàn)。取同一種供試品，制備成6份供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜方法依次進(jìn)樣，每次10 μL，以蒙花苷為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.47%，相對(duì)峰面積RSD均<1.08%，表明該方法重復(fù)性較好，符合指紋圖譜測(cè)定的要求。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一份供試品，分別于室溫放置0、4、8、12、16、24 h 后按照上述方法測(cè)定。以蒙花苷為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.78%，相對(duì)峰面積RSD均<1.41%，表明該供試品至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 HPLC指紋圖譜建立 取野菊花的花蕾、莖、葉制備的供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，得到各個(gè)樣品的色譜峰。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 野菊花不同部位蒙花苷含量

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算野菊花花蕾、莖、葉中所含蒙花苷含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3數(shù)據(jù)可知，野菊花的花蕾中蒙花苷含量最高，且不同產(chǎn)地的花蕾中蒙花苷含量也不同。

表3 野菊花花蕾、桿、葉中蒙花苷含量 (n=3)

3.2 野菊花不同部位指紋圖譜

按照“2.2.1”項(xiàng)下方法，分別將對(duì)照品溶液，野菊花的花蕾、莖、葉供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖1、圖2所示。

4 討論

野菊花生物活性多樣、清香宜人、藥源廣泛、安全可靠，在藥品、食品、保健品、化妝品等多領(lǐng)域具有開(kāi)發(fā)價(jià)值，目前人們使用的野菊花藥材主要以花蕾(頭狀花序)為主。本文測(cè)定了野菊花花蕾、莖、葉部位的蒙花苷含量，并建立了其HPLC指紋圖譜，以期為野菊花藥材的臨床應(yīng)用和資源開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的野菊花花蕾中蒙花苷含量有很大差異，且花蕾中蒙花苷含量多于莖和葉。野菊花的花蕾、莖和葉三個(gè)部位的HPLC圖譜出峰個(gè)數(shù)差異較大，相同成分含量也不盡相同。由此可見(jiàn)，在臨床用藥時(shí)，宜將野菊花不同部位分開(kāi)使用。

圖1 對(duì)照品HPLC圖譜

S1(廣東佛山)；S2(廣東清遠(yuǎn))；S3(湖北宜昌)

本研究?jī)H對(duì)一個(gè)產(chǎn)地的野菊花花蕾、莖和葉三個(gè)部位的蒙花苷含量和HPLC指紋圖譜進(jìn)行了研究，后期我們將繼續(xù)研究多個(gè)產(chǎn)地、不同提取方法和不同采收條件下野菊花不同部位有效成分的含量及指紋圖譜。