張智敏，聶 莼，李亞梅 ，彭買姣，羅 堃*，嚴(yán)建業(yè),3*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)湖南省 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)分析檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙410208)

枳殼(AurantiiFructus)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)[1]，為臨床最常用的理氣藥物之一，具有理氣寬中、行滯消脹的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，枳殼具有調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、抗抑郁、抑菌等藥理作用[2]。枳殼揮發(fā)油作為枳殼的主要成分，具有理氣、行滯、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌等作用[3]。枳殼揮發(fā)油為單萜及其含氧衍生物[4]，其中以檸檬烯含量最高[5]，被認(rèn)為是枳殼理氣作用的重要成分[4]。此外，檸檬烯還具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌等活性[6]。枳殼生品較峻烈[7]，中醫(yī)認(rèn)為檸檬烯具有燥性，身體虛弱者服用會(huì)傷及元?dú)?，麥麩皮能抑制枳殼酷性，令其勿傷膈，欲制其燥性，助其消?dǎo)，可炒置用之[8]。本研究旨在分析麩炒炮制法對(duì)不同產(chǎn)地枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量的影響，以及枳殼揮發(fā)油的抑菌活性與其主要成分檸檬烯的關(guān)系，為枳殼揮發(fā)油的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，并為深入研究枳殼藥材提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

GC-2010型氣相色譜儀(日本島津有限公司)；1510型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技上海儀器有限公司)；LDZM-60KCS型高壓蒸汽滅菌鍋(上海永安醫(yī)療器械廠)；DH-400AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱(成都致力儀器有限公司)；ZHWY-200D型恒溫振蕩器(上海智仁分析儀器制造有限公司)；DEN-1型麥?zhǔn)媳葷醿x(EU for Grant Instrucments Ltd)；萬(wàn)分之一分析天平(美國(guó)奧豪斯)；JK-G-522B3高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司)；DZTW型調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器)；揮發(fā)油提取裝置(蜀牛有限公司)；SW-CJ-2FD 型凈化工作臺(tái)(南京迅達(dá)空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 藥材與試劑

13批枳殼藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，來(lái)源及產(chǎn)地見(jiàn)表1。二甲基亞砜(DMSO)、乙酸乙酯、無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇為色譜純；氨芐西林(編號(hào)：A100339-0005，生工生物工程(上海)股份有限公司)；硫酸慶大霉素碳酸鉍(山西云鵬制藥有限公司)。

表1 枳殼樣品信息

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌ATCC26003、表皮葡萄球菌、大腸桿菌ATCC44138、沙門氏菌ATCC50115均來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.4 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(杭州濱河生物試劑有限公司，批號(hào)：140720)；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：130730)。

2 方法與結(jié)果

2.1 枳殼炮制品制備

方法參照2015年版《中國(guó)藥典》。

2.2 枳殼揮發(fā)油提取

枳殼生品和枳殼炮制品粉碎過(guò)40目篩，分別取1 kg粉末樣品，置于10 000 mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水浸泡過(guò)夜，安裝揮發(fā)油提取裝置，參考《中國(guó)藥典》2015年版第四部通則2204揮發(fā)油測(cè)定法提取枳殼揮發(fā)油，經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥后，封裝備用。

2.3 氣相色譜分析

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)品0.827 2 g，用色譜純甲醇定容至10 mL，配制成82.72 mg/mL的檸檬烯對(duì)照品溶液。用移液槍分別精密吸取檸檬烯(濃度為82.72 mg/mL)對(duì)照品溶液0.20、0.50、1.00、1.50、2.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用色譜純甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾頭過(guò)濾后，備用。

2.3.2 供試品溶液制備 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下所得揮發(fā)油 200 μL，用乙酸乙酯定容至5 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后，冷藏備用。

2.3.3 色譜條件 色譜柱：石英毛細(xì)管柱Rtx-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；樣口溫度：250 ℃；程序升溫：50 ℃保持 5 min，然后以 10 ℃/min 升至230 ℃，保持10 min。進(jìn)樣量為0.8 μL，分流比為10∶1，柱壓為100 kPa，載氣流量為18.30 mL/min。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度梯度的對(duì)照品溶液，分別注入氣相色譜儀中。以檸檬烯質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得對(duì)照品回歸方程為Y=2E+06X-968 311，檸檬烯在 1.654～16.544 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積積分線性關(guān)系良好，R2=0.995 7。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下同一供試品溶液(S4)，在“2.3.3” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰峰面積，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于 3%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下同一供試品溶液(S4)，分別于放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定各主要色譜峰峰面積，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均<2.11%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取S4號(hào)樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法提取枳殼揮發(fā)油，并按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定色譜峰峰面積，色譜圖中各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均<3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 回收率試驗(yàn) 精密吸取3份S4號(hào)樣品各1 mL，分別加入檸檬烯含量為4.136 mg/mL、8.272 mg/mL、12.396 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品各1 mL，混勻后每個(gè)樣品測(cè)定3次，得出平均回收率為96.96%，RSD為1.2%。

2.4 枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量測(cè)定

取供試品溶液按照“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析(檸檬烯對(duì)照品和枳殼揮發(fā)油樣品的氣相色譜如圖1所示)，記錄色譜峰峰面積，采用外標(biāo)法，將供試品中檸檬烯的峰面積代入“2.3.4”項(xiàng)下回歸方程中計(jì)算其濃度，并換算成每1毫升揮發(fā)油中的檸檬烯含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

A-檸檬烯對(duì)照品GC色譜；B-枳殼揮發(fā)油GC色譜(S9)；a-檸檬烯

表2 枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量測(cè)定結(jié)果

由表2數(shù)據(jù)可知，不同產(chǎn)地的枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量存在差異，其中湖南和江西產(chǎn)地枳殼的檸檬烯含量較高，而河北產(chǎn)地的檸檬烯含量較低?？傮w來(lái)說(shuō)，經(jīng)麩炒炮制后，枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量呈下降趨勢(shì)。據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道，枳殼麩炒后，其揮發(fā)油含量會(huì)降低，其中檸檬烯等低沸點(diǎn)組分含量有所下降，與本研究結(jié)果基本吻合。

2.5 抑菌活性檢測(cè)

2.5.1 供試品溶液制備 分別精確吸取“2.2”項(xiàng)下?lián)]發(fā)油樣品1 mL，與40% DMSO等體積混合均勻，臨用前無(wú)菌濾過(guò)，即為揮發(fā)油供試品溶液。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品粉末500 mg，用無(wú)菌水定容至5 mL，得100 mg/mL的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液200 μL，用無(wú)菌水稀釋至100 mL，得到200 μg/mL氨芐西林陽(yáng)性對(duì)照品溶液。精密稱取每0.6 g含40 mg慶大霉素的硫酸慶大霉素碳酸鉍0.3 g，用無(wú)菌水稀釋至100 mL，得到200 μg/mL慶大霉素陽(yáng)性對(duì)照品溶液。

2.5.3 菌懸液配制 分別將實(shí)驗(yàn)用菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑選特征菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h后，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ脽o(wú)菌生理鹽水將其稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷釂挝?，?.5×108CFU/mL菌懸液，備用。

2.5.4 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定 在無(wú)菌的96孔板A-H排每孔中各加入100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯，分別吸取四種預(yù)先配制的揮發(fā)油供試品溶液各100 μL至A排1-3/4-6/7-9/10-12孔(即每塊96孔板做一種菌的4個(gè)不同供試品，每個(gè)供試品重復(fù)操作3次)，混合均勻；從A排每孔分別吸取100 μL溶液至B排相應(yīng)孔，依次倍比稀釋(吸取前注意混合均勻)，H排各孔棄去100 μL溶液。同時(shí)設(shè)置氨芐西林陽(yáng)性對(duì)照和慶大霉素陽(yáng)性對(duì)照(以倍比稀釋的抗生素替代藥液)、無(wú)菌水陰性對(duì)照、40% DMSO陰性對(duì)照、揮發(fā)油供試品溶液空白對(duì)照(以無(wú)菌水替代菌液)、培養(yǎng)基空白對(duì)照(以無(wú)菌水替代藥液及菌液)。最后于每孔中各加入100 μL菌懸液(1.5×108CFU/mL)，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察，并于600 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)。目測(cè)抑菌液濃度最低且澄清的孔(即(A供試品-A供試品空白對(duì)照)/A培養(yǎng)基空白≈1)所對(duì)應(yīng)的即為最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 枳殼揮發(fā)油MIC測(cè)定結(jié)果 (μL/mL)

由表3可以看出，枳殼揮發(fā)油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)的抑菌效果要強(qiáng)于革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和沙門氏菌)，這是由于革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同：革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁有一個(gè)額外的外膜組成的雙層脂多糖[10]，脂多糖分子通過(guò)排斥揮發(fā)油的疏水性成分形成屏障，阻止揮發(fā)油進(jìn)入細(xì)胞壁內(nèi)[11]。而革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁只有一層,主要由肽聚糖組成，由于缺少這種屏障，揮發(fā)油中的疏水性成分更易滲透，一些成分與細(xì)胞壁上的特定靶點(diǎn)結(jié)合，從而破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞質(zhì)流出，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[12]。但是S4、S8、S13、S17枳殼揮發(fā)油出現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的抑菌活性強(qiáng)于金黃色葡萄球菌的現(xiàn)象，這可能是由于細(xì)菌上的不同細(xì)胞靶點(diǎn)以多種形式結(jié)合揮發(fā)油的不同成分，從而使沙門氏菌對(duì)枳殼揮發(fā)油比革蘭氏陽(yáng)性菌更加敏感[13]。

此外，由表3可知，枳殼經(jīng)麩炒炮制后，其揮發(fā)油的抑菌活性有所增強(qiáng)，該結(jié)果與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的結(jié)論一致。

2.6 檸檬烯含量與抑菌活性關(guān)聯(lián)分析

采用SPSS17.0中雙變量相關(guān)分析方法，以枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量作為X變量，1/MIC值作為Y變量，計(jì)算兩者的Pearson相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 檸檬烯含量與抑菌活性的Pearson相關(guān)性

注：X：枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量；Y1：大腸桿菌的1/MIC值；Y2：沙門氏菌的1/MIC值；Y3：金黃色葡萄球菌的1/MIC值；Y4：表皮葡萄球菌的1/MIC值。

由表4可知，枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量與其對(duì)表皮葡萄球菌和沙門氏菌的1/MIC呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明枳殼揮發(fā)油中檸檬烯所占比例越小，其揮發(fā)油對(duì)表皮葡萄球菌和沙門氏菌的抑制作用越強(qiáng)；枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量與其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的1/MIC呈正相關(guān)，說(shuō)明枳殼揮發(fā)油中檸檬烯所占比例越大，其揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用越強(qiáng)。

3 討論

本研究探討了麩炒炮制對(duì)枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量的影響，并初步分析了枳殼揮發(fā)油的抑菌活性與檸檬烯含量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)麩炒會(huì)降低枳殼檸檬烯含量。此外，枳殼揮發(fā)油中檸檬烯含量越高，其揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用越強(qiáng)。然而，植物揮發(fā)油的抑菌效果可能是其揮發(fā)油中多種成分協(xié)同作用的結(jié)果[15]。因此，分析枳殼揮發(fā)油中其他低含量成分對(duì)枳殼揮發(fā)油抑菌活性的影響，針對(duì)枳殼揮發(fā)油抑菌活性進(jìn)行全面的譜效分析以及開(kāi)展驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將是下一步的研究方向。