李衛(wèi)先，劉園園，王議憶，李 達(dá)

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012)

四物湯是治療血虛證的基礎(chǔ)方劑，具有增強(qiáng)免疫力、補(bǔ)血活血的作用，在古代文獻(xiàn)資料中均記載其既能“補(bǔ)血”，又具有“活血”之功。四物湯主要由當(dāng)歸、川芎、芍藥、熟地黃四味中藥組成[1]。原方源于《仙授理傷續(xù)斷秘方》，但原方并未闡明方中各藥所用的具體炮制品, 故本研究在探討藥物原料的炮制方法時(shí)，應(yīng)該力求增強(qiáng)其補(bǔ)血活血的功能，通過(guò)對(duì)比不同炮制品組成的四物湯的補(bǔ)血作用，以期確證四物湯在治療營(yíng)血虧虛及血行不暢時(shí)組方中當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃的具體炮制品。

1 材料

1.1 儀器

LBY-F6粘附儀(北京普利出品)；RA2型紅細(xì)胞電泳儀(上海)；7170型日立生化分析儀；CKX41SF 倒置顯微鏡(OLYPUS公司出品)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地等藥材均由湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬一醫(yī)院提供，依據(jù)《中國(guó)藥典》(2015年版一部)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)判定為合格藥材。注射用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CY),由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司出品,批號(hào)：06121021。黃酒(15°花雕酒,浙江紹興湖塘釀酒廠),白酒(55°紅星二鍋頭，北京釀酒總廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar 小鼠360只，清潔級(jí),體重18～22 g, ♀♂各半，Wistar大鼠48 只，體重為150～200 g，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2016-0012。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲用過(guò)濾凈化處理水。

2 方法

2.1 樣品分組及提取

2.1.1 樣品分組 按《方劑學(xué)》教材規(guī)定的劑量分批稱取四物湯[1]，共分6組：①第1組:各組分均為生品(熟地黃清蒸)的四物湯水煎液，藥物組成：清蒸熟地黃12 g、白芍12 g、當(dāng)歸10 g、川芎8 g等；②第2組：各組分均為酒炙品即酒熟地黃、酒白芍、酒當(dāng)歸、酒川芎組方的四物湯,各藥用量同A組；③第3組：熟地黃酒蒸、其他藥物均為生品組方的四物湯, 各藥用量同A組；④第4組：白芍酒炙，其它藥物均為生品(熟地黃清蒸)組方的四物湯，各藥用量同A組；⑤第5組：當(dāng)歸酒炙，其他藥物均為生品(熟地黃清蒸)組方的四物湯,各藥用量同A組；⑥第6組：川芎酒炙，其他藥物均為生品(熟地黃清蒸)組方的四物湯,各藥用量同A組。

2.1.2 樣品提取 以上各組按量稱取各藥后，常溫(25 ℃)浸泡30 min，加蒸餾水2 000 mL，煮沸后文火煎30 min，過(guò)濾藥液，藥渣加蒸餾水再煎煮25 min，合并兩次濾液，濃縮至四物湯配制成生藥含量為1 g/mL的提取液備用。

2.2 不同炮制品組成的四物湯補(bǔ)血作用實(shí)驗(yàn)

2.2.1 血虛動(dòng)物模型外周血象 取體質(zhì)量(20±2)g小鼠120只，每組有效動(dòng)物數(shù)15只，♀♂各半，按性別體質(zhì)量隨機(jī)分成正常組，模型組，1、2、3、4、5、6組，各藥物組小鼠每日灌胃給予生藥10 g/kg相應(yīng)藥[2], 正常對(duì)照組與模型組小鼠給予等容量生理鹽水。模型組及1、2、3、4、5、6組小鼠分別于給藥第2日、第5日皮下注射乙酰苯肼20 mg/kg、40 mg/kg，從第5日起, 每日腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg，連續(xù)4日。對(duì)照組小鼠同時(shí)注射等容量生理鹽水，于末次給藥1.5 h后觀察小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)并眼眶取血,按文獻(xiàn)方法計(jì)數(shù)紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血紅蛋白含量、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)骨髓有核細(xì)胞數(shù)[2]。

2.2.2 血虛動(dòng)物模型骨髓有核細(xì)胞數(shù)的觀察 分組給藥同“2.2”項(xiàng)，各組于末次給藥1.5 h后，取小鼠一側(cè)股骨,以3%醋酸溶液10 mL沖洗出骨髓,計(jì)數(shù)骨髓有核細(xì)胞數(shù)。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較各組的差異。

2.2.3 血虛小鼠游泳時(shí)間 分組給藥同“2.2.1”項(xiàng)，各組末次給藥后30 min，將1、2、3、4、5、6各小組，正常組，模型組小鼠放入水溫20 ℃水深25 cm，內(nèi)壁光滑的水桶中游泳，同時(shí)用秒表記錄游泳時(shí)間。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較各組的差異。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較各組的差異。

2.2.4 對(duì)血虛證小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響分組給藥同“2.2”項(xiàng)，在實(shí)驗(yàn)第7天稱取動(dòng)物體質(zhì)量后，第8天頸椎脫臼處死，剖腹取肝臟、脾臟及胸腺，生理鹽水沖洗，洗凈血污，剝離臟器表面脂肪及結(jié)締組織等，濾紙吸干水分，稱脾臟及胸腺質(zhì)量，以備用于檢測(cè)脾、胸腺指數(shù)。用t檢驗(yàn)比較各組體質(zhì)量的差異。計(jì)算公式如下：脾指數(shù)=脾質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較各組的差異。

2.3 不同炮制品組成的四物湯活血化瘀作用實(shí)驗(yàn)

2.3.1 對(duì)血虛證血虛血瘀模型大鼠耳廓微循環(huán)血流量的影響 取體質(zhì)量(150±200)g雄性大鼠80只，每組有效動(dòng)物數(shù)10只，隨機(jī)分成正常組，模型組，1、2、3、4、5、6組，正常對(duì)照組大鼠給予等容量生理鹽水；模型組及1、2、3、4、5、6組大鼠分別于給藥第2日、第5日皮下注射乙酰苯肼20 mg/kg、40 mg/kg，從第5日起, 每日腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg，連續(xù)4日[3]。各組動(dòng)物最后一次在給予環(huán)磷酰胺35 min后, 按0.3 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉, 用多普勒微循環(huán)檢測(cè)儀檢測(cè)耳廓微循環(huán)血流量。第6天始，1、2、3、4、5、6組大鼠每日灌胃給予10 g生藥/kg相應(yīng)藥, 正常對(duì)照組與模型組小鼠給予等容量生理鹽水，連續(xù)6天。第13天, 各組動(dòng)物于給藥30 min后，用與前同樣方法檢測(cè)耳廓微循環(huán)血流量。

2.3.2 對(duì)血虛證血虛血瘀模型大鼠耳廓微血管流速和管徑影響 按“2.3.1”項(xiàng)方法分組給藥，在第14天, 各組動(dòng)物于給藥30 min后, 按0.3 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉動(dòng)物, 用微循環(huán)圖像分析儀測(cè)耳廓微血管流速及管徑。

3 結(jié)果

3.1 不同炮制方法組成的四物湯補(bǔ)血作用比較

3.1.1 對(duì)血虛小鼠外周血象及骨髓有核細(xì)胞的影響 與空白組比較，模型組外周血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及骨髓有核細(xì)胞數(shù)均降低，網(wǎng)織細(xì)胞數(shù)均升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，不同炮制品組成的四物湯各組均能不同程度升高脾虛小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)以及血紅蛋白及骨髓有核細(xì)胞的含量，且均能不同程度降低網(wǎng)織紅細(xì)胞的含量，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中(2、3、5組)即各組分均為酒炙品組方的四物湯組與熟地黃酒炙組方的四物湯組及當(dāng)歸酒炙組方的四物湯組均能顯著升高脾虛小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及骨髓有核細(xì)胞的含量，并能顯著降低脾虛小鼠網(wǎng)織細(xì)胞含量，與其他各組、生品組比較，有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且第2組作用強(qiáng)于3組、5組，與3組、5組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明各組分均為酒炙品組成的四物湯對(duì)于血虛證小鼠外周血象、骨髓造血功能有明顯改善作用。如表1所示。

3.1.2 對(duì)脾虛小鼠游泳時(shí)間的影響 與空白組相比，模型組小鼠體溫降低，游泳時(shí)間縮短，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，不同炮制品組成的四物湯各組均能不同程度延長(zhǎng)脾虛小鼠游泳時(shí)間，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；其中，2、3、5組，即各組分均為酒炙品組方的四物湯組與熟地黃酒炙組方的四物湯組及當(dāng)歸酒炙組方的四物湯組均能顯著延長(zhǎng)脾虛小鼠的游泳時(shí)間，與其他各組及生品組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且第2組作用強(qiáng)于3組、5組，與3組、5組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明組分均為酒炙品組成的四物湯對(duì)于血虛證小鼠有明顯的抗疲勞作用。如表2所示。

3.1.3 對(duì)脾虛小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、體質(zhì)量的影響 與空白組比較，模型組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、體質(zhì)量均降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( p<0.01)；與模型組比較，不同炮制品組成的四物湯各組均能不同程度升高脾虛小鼠的脾指數(shù)、體質(zhì)量，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；其中，2、3、5組，即各組分均為酒炙品組方的四物湯組與熟地黃酒炙組方的四物湯組及當(dāng)歸酒炙組方的四物湯組均能顯著升高脾虛小鼠的脾指數(shù)、體質(zhì)量，與其他各組及生品組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且第2組作用強(qiáng)于3組、5組，與3組、5組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明組分均為酒炙品組成的四物湯對(duì)于血虛證小鼠有明顯的抗疲勞作用，組分均為酒炙品組成的四物湯可使血虛證小鼠免疫器官增重，對(duì)于免疫功能有改善作用，但各組脾虛小鼠的胸腺指數(shù)雖有升高趨勢(shì)，與模型組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

3.2 不同炮制方法組成的四物湯活血化瘀作用比較

3.2.1 對(duì)血虛證血虛血瘀模型小鼠耳廓微循環(huán)血流量的影響 給藥前, 模型組及給藥各組微循環(huán)血流量與空白組比較，均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01), 耳廓微循環(huán)血流量明顯下降,血流不暢。給藥后,各給藥組均能不同程度增加微循環(huán)血流量，與給藥前比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；其中,2、5、6組，即各組分均為酒炙品組方的四物湯組與當(dāng)歸酒炙組方的四物湯組及川芎酒炙組方的四物湯組與其他各組及生品組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且第2組作用強(qiáng)于5組、6組，與5組、6組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明組分均為酒炙品組成的四物湯可明顯改善血虛證血虛血瘀小鼠微循環(huán)血流量，且優(yōu)于其他各組。見(jiàn)表2。

3.2.2 對(duì)血虛證血虛血瘀模型大鼠耳廓微血管流速的影響 模型組微動(dòng)脈、微靜脈流速均低于空白組, 有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01), 表現(xiàn)為微血管血流速減慢。而給藥后, 各給藥組均能不同程度增加微動(dòng)脈和微靜脈流速,與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；其中,2、5、6組，即各組分均為酒炙品組方的四物湯組與當(dāng)歸酒炙組方的四物湯組及川芎酒炙組方的四物湯組與其他各組及生品組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且第2組作用強(qiáng)于5組、6組，與5組、6組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明組分均為酒炙品組成的四物湯可顯著增加微動(dòng)脈和微靜脈流速。見(jiàn)表3。

3.2.3 對(duì)血虛證血虛血瘀模型大鼠耳廓微血管管徑的影響 模型組微血管管徑均低于空白組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，提示模型建立成功。而給藥后, 各給藥組均能不同程度擴(kuò)張微血管管徑,與模型組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；其中,2、5、6組，即各組分均為酒炙品組方的四物湯組與當(dāng)歸酒炙組方的四物湯組及川芎酒炙組方的四物湯組與其他各組及生品組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且第2組作用強(qiáng)于5組、6組，與5組、6組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明組分均為酒炙品組成的四物湯可顯著增加微動(dòng)脈和微靜脈流速和微靜脈血管管徑。見(jiàn)表3。

組別有效動(dòng)物數(shù)(只)紅細(xì)胞(1012/L)白細(xì)胞數(shù)(109/L)血紅蛋白(g/L)網(wǎng)織紅細(xì)胞(個(gè)/1000RBC)骨髓有核細(xì)胞數(shù)(104/L)空白組1510.07±0.897.11±2.31151.65±8.646.31±8.64425.61±13.62模型組157.23±0.74①5.06±2.59①104.21±9.32①204.34±3.65①163.41±14.82①1158.45±0.88②6.31±1.98②125.65±9.87②95.74±3.51②285.48±10.32②21510.14±0.72②③8.19±2.14②150.94±8.32②12.16±3.41②③414.28±16.72②③3159.13±0.67②7.18±2.58②138.67±8.94②31.38±3.64②374.38±12.36②4158.75±0.59②6.53±1.67①128.23±9.67②85.57±2.81②301.45±15.96①5159.07±0.84②7.05±2.48②135.52±8.51②38.91±3.62②354.54±13.19②6158.69±0.71②6.50±2.79127.61±8.76②81.74±2.88②295.71±15.84①

注：與空白組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.01；與生品組比較，③P<0.01。

組別游泳時(shí)間(s)脾指數(shù)(mg/g)胸腺指數(shù)(mg/g)體質(zhì)量(g)給藥前給藥7天大鼠耳廓微循環(huán)血流量(LSPU)給藥前給藥后空白組3842 ± 24110.38±1.692.14±0.6122.6±1.724.6±1.70.276±0.0750.284±0.087模型組2131 ± 2137.17±1.54①1.57±0.5321.8±1.218.6±1.9①0.128±0.056①0.096±0.079①13951± 268①10.54±1.67②1.61±0.5921.3±1.522.5±1.4④0.125±0.0500.195±0.085②24387 ± 236①12.98±1.38②1.91±0.6322.5±1.825.2±1.6④0.123±0.0540.312±0.076②④③34212 ± 238①11.61±1.851.74±0.5421.4±1.723.8±1.8④0.126±0.0880.198±0.067②④③44057 ± 274①10.51±1.691.63±0.6720.7±1.622.1±1.70.124±0.0680.202±0.072②④③54228 ± 263①11.58±1.541.71±0.6120.3±1.523.6±1.5④0.125±0.0650.268±0.078#②④③64046 ± 252①10.73±1.721.65±0.5222.2±1.423.9±1.30.127±0.0720.264±0.074#②④

注：與空白組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與生品組比較，③P<0.01；與給藥前比較，④P<0.01。

組別微動(dòng)脈流速(μm·s-1)微靜脈流速(μm·s-1)微動(dòng)脈管徑(μm)微靜脈管徑(μm)空白組811.3± 32.4862.4± 36.163.2± 11.442.3± 8.6模型組618.7 ± 38.2①651.2± 39.7①26.1± 10.2①18.6± 7.5①1715.6± 34.6①747.4± 32.8①38.4± 12.5①③27.8± 7.8①2821.1 ± 30.4①③868.6 ± 35.4①③63.8 ± 11.6①43.9± 6.4①③3730.6 ± 29.5①734.7 ± 37.6①43.5 ± 9.8①29.8 ± 8.3①4726.2 ± 28.6①732.3± 34.1①42.1± 12.7①28.3± 8.7①5767.4 ± 29.7①785.6 ± 33.2①53.2± 12.1①33.4± 6.8①6779.5± 36.5①791.7± 35.4①55.6± 10.8①34.7±9.2①

注： 與空白組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.01；與生品組比較，③P<0.01。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，血虛則脈道失于充盈，血行不暢易致血瘀，舊瘀不除則新血不生，又會(huì)導(dǎo)致血虛。因此，中醫(yī)治療血虛常用祛瘀生新法。四物湯是祖國(guó)醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)的補(bǔ)血名方，可補(bǔ)血活血、化瘀生新。本方多以臨床應(yīng)用和藥理研究報(bào)道為多，而關(guān)于四物湯炮制研究的報(bào)道則極少。中藥炮制理論中，認(rèn)為中藥酒炙后，能增強(qiáng)活血散瘀、祛風(fēng)通絡(luò)的作用。然臨床應(yīng)用中亦無(wú)明確表明該方中當(dāng)歸、白芍、川芎等是用生品還是用酒炙品，熟地黃是清蒸還是酒蒸，是何種炮制品有效，這些都無(wú)人研究，使臨床用藥缺乏科學(xué)性，勢(shì)必影響臨床用藥的有效性。本研究以血虛小鼠外周血象、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、游泳時(shí)間、體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、微循環(huán)血流量、微血管流速和管徑為指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行了研究，從而確定方中藥物是否需要酒炙。本實(shí)驗(yàn)以血虛小鼠外周血象、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、游泳時(shí)間、體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、微循環(huán)血流量、微血管流速和管徑為指標(biāo)，觀察不同炮制方法對(duì)四物湯補(bǔ)血活血作用的影響。結(jié)果顯示，由不同炮制品組方的四物湯均能不同程度升高脾虛小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及骨髓有核細(xì)胞的含量，延長(zhǎng)脾虛小鼠的游泳時(shí)間、增加微循環(huán)血流量、增加微動(dòng)脈和微靜脈流速和擴(kuò)張微動(dòng)脈和微靜脈血管管徑，但以各組分均為酒炙品組方的四物湯組作用最強(qiáng)。酒蒸熟地黃組方的四物湯組雖能升高脾虛小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及骨髓有核細(xì)胞的含量，但其擴(kuò)張模型動(dòng)物微血管、增加微血管管徑、加快微動(dòng)脈和微靜脈的血流速度作用不及酒炙當(dāng)歸組方的四物湯組，和酒炙川芎組方的四物湯組，及各組分均為酒炙品組方的四物湯組，酒炙川芎組方的四物湯組雖能增加微循環(huán)血流量、增加微動(dòng)脈和微靜脈流速和擴(kuò)張微動(dòng)脈和微靜脈血管管徑，但其升高脾虛小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及骨髓有核細(xì)胞的含量作用不及酒炙當(dāng)歸組方的四物湯組和酒蒸熟地黃組方的四物湯組及各組分均為酒炙品組方的四物湯組。因此，四物湯臨床上用于營(yíng)血虛滯、出血性瘀血伴血虛或產(chǎn)后瘀血出血時(shí)，方中藥物均需酒炙，這對(duì)臨床合理使用此方，增強(qiáng)其臨床療效，闡明炮制對(duì)方劑的影響提供了依據(jù)，同時(shí)也驗(yàn)證了四物湯補(bǔ)血活血作用。