陳路燕，褚珊珊，左紹遠(yuǎn)

(大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000)

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。在我國肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率均高于世界平均水平。目前臨床上主要采取手術(shù)、化療、放療等方法治療，但毒副作用較大，尚未取得較滿意的療效。因此，積極尋找高效、低毒的抗肝癌藥物成為當(dāng)前醫(yī)藥學(xué)界面臨的一項(xiàng)重要任務(wù)。紅花即菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)，為一年生草本植物，是一種傳統(tǒng)中藥。味辛、性溫，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛、軟堅(jiān)散結(jié)等功效[1-2]。蜂花粉(bee pollen) 系蜜蜂從蜜源植物雄性花蕊內(nèi)采集的花粉粒，經(jīng)蜜蜂加工而成的扁圓形狀物，具有多種生物活性和藥理作用[3]。多糖是通過糖苷鍵將10 個(gè)以上的單糖連接形成的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子物質(zhì)，具有多種生物活性和藥理作用[4]。多糖可提高機(jī)體的免疫功能，不僅能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞免疫水平，而且能促進(jìn)干擾素、白介素、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)了抑瘤和抗癌作用。多糖是蜂花粉的主要活性成分之一，研究表明，不同來源的蜂花粉多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種生物學(xué)活性[5]。在前期研究中，我們利用水提醇方法分離提取出紅花蜂花粉總多糖(polysaccharide of bee pollen of carthamus tinctorius, 2PBPC)，并利用DEAE-52纖維素柱和SehpadexG100柱兩種柱層析法從PBPC中分離純化出5個(gè)均一的多糖級分(PBPCⅠ、PBPCⅡ、PBPCⅢ、PBPCⅣ，PBPCⅤ)[6]。前期研究表明，PBPC具有提高機(jī)體免疫力、抗氧化、抗凝血等活性[7,8]。為進(jìn)一步探索PBPC的生物學(xué)活性，本實(shí)驗(yàn)觀察了PBPCⅠ對H22荷瘤BALB/c小鼠的抑瘤作用及其作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步深入研究PBPCⅠ的抗腫瘤活性及藥理學(xué)作用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌性BALB/c 雌性小鼠60只，SPF級，體質(zhì)量16～20 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 樣品、試劑及主要儀器

紅花蜂花粉，云南滇峰蜂業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號：20140712；木瓜蛋白酶、透析袋，北京索萊寶科技有限公司；DEAE-52cellulose，北京科技有限公司；H22肝癌細(xì)胞株，上海澤葉生物科技有限公司；IL-1α、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-2、VEGF、ELISA試劑盒，伊萊瑞特生物科技股份有限公司；環(huán)磷酰胺(CTX)，江蘇圣迪醫(yī)藥有限公司(批號：18022825)；SHA-C恒溫水浴箱，金壇市杰瑞爾電氣有限公司；AG135電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞東生化儀器廠；MB-53多功能酶標(biāo)分析儀，深圳市惠松科技發(fā)展有限公司；超凈臺，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PBPCⅠ提取、分離純化的工藝流程 紅花蜂花粉→石油醚、無水乙醇回流→水浴，收集濾液→濃縮至一定體積→2%(W/W)酶， Sevage液(氯正比4∶1)脫蛋白→離心取上清液→醇沉→離心取沉淀→無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌→冷凝干燥→DEAE-52纖維素柱分離組分→透析醇沉→PBPCⅠ組分→冷凍干燥后置干燥瓶中，-20℃保存?zhèn)溆肹9-17]。

1.3.2 動物造模、分組及給藥 BALB/c 雌性小鼠60只，隨機(jī)分為六組：腫瘤模型組、正常對照組、CTX組以及PBPCⅠ低、中、高劑量組，每組10只，稱取體質(zhì)量。除正常對照組外，其余各組小鼠均在右前肢腋窩皮下注射細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL 0.2 mL的H22肝癌細(xì)胞，建立H22肝癌模型。接種24 h后，正常對照組、腫瘤模型組灌胃等量的生理鹽水(0.1 mL/10 g)，給藥組分別灌胃PBPCⅠ100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg，CTX組皮下注射30 mg/kg，每天1次，連續(xù)給藥15天。

1.3.3 PBPCⅠ對腫瘤抑制作用及對免疫器官指數(shù)的影響 末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量，脫頸處死，剝離瘤塊，取出脾臟及胸腺，用濾紙吸凈血液分別稱質(zhì)量。抑瘤率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量/模型組瘤質(zhì)量)×100%;免疫器官指數(shù)=免疫器官質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.3.4 PBPCⅠ對荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子的影響 末次給藥后，各組禁食不禁水12 h，眼球取血，收集血液，靜置30 min，離心，取上清，ELISA法測血清中IL-1α、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-2 、VEGF含量，操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PBPCⅠ對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

圖1表明，除正常對照組外，給藥15天后，不同組別有顯著變化，與對照組相比，低、中、高、CTX組腫瘤存在不同明顯差異，CTX組腫瘤較小，而低、中、高劑量組隨著用藥劑量的增加，腫瘤逐漸減小。

注：Low(100 mg/kg)、Middle(200 mg/kg)、High(400 mg/kg)，CTX(30 mg/kg)，control(正常對照組)

2.2 PBPCⅠ對腫瘤抑制作用及對免疫器官指數(shù)的影響

結(jié)果表明，給藥前各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，而給藥結(jié)束后各組小鼠質(zhì)量發(fā)生明顯變化。與荷瘤瘤模型組相比，PBPCⅠ低、中、高劑量組與CXT組小鼠體質(zhì)量均明顯增加。PBPCⅠ低、中、高劑量組與CTX組均能抑制H22肝癌腫瘤的生長，抑瘤率分別為33.48%、45.69%、57.86%、67.93%，表明不同濃度的PBPCⅠ均能抑制腫瘤的生長，但其抑瘤作用比CTX組弱。另外，與正常對照組相比， CTX組小鼠胸腺指數(shù)降低(P<0.01)，而模型組、PBPCⅠ低、中、高劑量組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)則不同程度升高(P<0.01)；與模型組相比，不同劑量的PBPCⅠ組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)升高，而CTX組小鼠脾指數(shù)與胸腺指數(shù)降低。結(jié)果見表1、表2。

組別劑量(mg/kg)體質(zhì)量(g)實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后瘤質(zhì)量(g)抑瘤率(%)正常對照組-17.87±0.6423.88±1.53--模型組-18.56±1.0431.43±0.781.54±0.19-CTX組3017.12±0.7525.53±1.35**0.50±0.03**67.93PBPCⅠ低劑量組10018.91±0.4327.67±1.39**1.02±0.11**33.48PBPCⅠ中劑量組20017.41±0.3328.14±1.54**0.84±0.04**45.69PBPCⅠ高劑量組40018.03±1.4029.27±0.14*0.65±0.04**57.86

注：與模型組比，*P<0.05，**P<0.01。

組別劑量(mg/kg)脾指數(shù)(mg/g)胸腺指數(shù)(mg/g)正常對照組-3.70±0.58##0.88±0.04##模型組-5.73±0.59**1.19±0.19**CTX組302.71±0.42##0.38±0.04**##PBPCⅠ低劑量組1006.1±0.25**1.42±0.09**#PBPCⅠ中劑量組2006.66±0.86**#2.16±0.21**##PBPCⅠ高劑量組4006.93±1.22**#2.17±0.13**##

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 PBPCⅠ對荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子的影響

與模型組相比，PBPCⅠ高劑量組、CTX組的IL-1α極顯著降低(P<0.01)，PBPCⅠ中劑量組顯著降低(P<0.05)；PBPCⅠ低、中、高劑量組、CTX組的IL-6極顯著降低(P<0.01)；PBPCⅠ低、中、高劑量組中的IFN-γ極顯著升高(P<0.01)。同時(shí)，與模型組相比，PBPCⅠ中、高劑量組中的TNF-α不同程度升高，而中劑量組顯著升高(P<0.05)，高劑量組極顯著升高(P<0.01)；PBPCⅠ低、中、高劑量組中的IL-2不同程度升高，而低劑量組顯著升高(P<0.05)，中、高劑量組極顯著升高(P<0.01)；PBPCⅠ中、高劑量組，CTX組的VEGF不同程度降低，而CTX組與PBPCⅠ高劑量組極顯著降低(P<0.01)，PBPCⅠ中劑量組顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表3、表4。

組別 劑量(mg/kg)IL-1α(ng/L)IL-6(ng/L)IFN-γ(ng/L)正常對照組-134.67±8.85**49.30±4.67**83.50±6.47**模型組-203.21±16.09140.22±6.2668.63±5.57CTX組30161.30±18.24**65.08±2.01**72.93±3.51PBPCⅠ低劑量組100189.39±5.27101.92±9.33**91.74±8.63**PBPCⅠ中劑量組200180.86±9.20*91.94±8.50**109.66±8.19**PBPCⅠ高劑量組400172.73±14.56**73.27±1.36**143.63±5.35**

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別劑量(mg/kg)TNF-α(ng/L)IL-2(ng/L)VEGF(ng/L)正常對照組-238.88±9.35*68.71±5.01*170.83±5.94**模型組-225.28±7.0958.31±2.48237.40±5.47CTX組30220.66±7.9451.18±5.84222.84±3.19**PBPCⅠ低劑量組100233.59±7.6268.47±6.56*233.40±3.36PBPCⅠ中劑量組200238.33±10.04*69.79±6.90**228.15±4.64*PBPCⅠ高劑量組400251.67±9.61**71.05±6.68**222.02±9.74**

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 PBPC I對H22荷瘤小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化的影響

與模型組相比，隨著PBPC Ⅰ劑量的升高，腫瘤組織越疏松，細(xì)胞減少，出現(xiàn)核濃縮、核碎裂、核分裂等凋亡特征，CTX組小鼠組織疏松，細(xì)胞顯著減少，并且出現(xiàn)了相應(yīng)的凋亡特征，說明PBPC Ⅰ具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。見圖2。

3 討論

IL-2刺激T細(xì)胞增生，故被稱為 T 細(xì)胞生長因子，誘導(dǎo) NK 細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ 等因子，高濃度的IL-2抑制腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)免疫功能，從而抑制腫瘤生長[18]。IFN-γ能有效地抑制腫瘤新血管的形成，直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，增加腫瘤壞死因子的表達(dá)以及表面抗體的相容性[19]。TNF-α可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及腫瘤組織壞死，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[20]。IL-6使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤生成[21-22]。VEGF具有誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)腫瘤生長，使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化，也能夠增加微血管通透性，對腫瘤的生長具有重要作用[18]。IL-1α促進(jìn)CD4T細(xì)胞活化以及激活NK細(xì)胞的活性，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義[23]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PBPCⅠ低、中、高劑量均具有明顯的抑制H22腫瘤生長的作用，其抑制率分別為33.48%、45.69%、57.86%。與腫瘤模型組相比，PBPCⅠ低、中、高劑量組的脾指數(shù)和胸腺指明顯升高，其作用優(yōu)于CTX。同時(shí)PBPCⅠ還能升高荷瘤小鼠血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平，降低血清IL-1α、IL-6、VEGF含量。由肝癌H&E染色發(fā)現(xiàn)PBPCⅠ具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PBPCⅠ抑制腫瘤生長的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，釋放殺傷腫瘤的細(xì)胞因子，從而抑制腫瘤生長。