孫志杰，許永亮，劉凌志，付楚溪，熊向華，畢秀麗，張惟材

1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；4.沈陽師范大學(xué)，遼寧 沈陽 110034

突觸小體相關(guān)蛋白25（synaptosomal associated protein 25，SNAP25），是可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體蛋白（SNARE）復(fù)合物的組成部分之一[1]，它通過形成一個(gè)將突觸囊泡和突觸前膜結(jié)合在一起的緊密復(fù)合物使二者發(fā)生融合[2]，同時(shí)驅(qū)動(dòng)神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中的胞吐作用，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放[3]。

肉毒桿菌神經(jīng)毒素（botulinum neurotoxins，BoNT）簡稱肉毒毒素，由厭氧的肉毒桿菌產(chǎn)生，是目前發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的蛋白毒素[4]。根據(jù)毒性的不同，可將肉毒毒素分為A～G共7種血清型。肉毒毒素由一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵連接構(gòu)成[5]。輕鏈?zhǔn)且环N將Zn2+作為輔助因子的金屬蛋白酶，可以特異性地切割SNARE復(fù)合物中的SNAP25蛋白，使突觸囊泡無法與突觸前膜融合，抑制神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，從而引發(fā)肌肉弛緩性麻痹，嚴(yán)重的肉毒中毒還可導(dǎo)致人畜死亡[6]。由于SNAP25是肉毒毒素輕鏈切割的底物，制備針對(duì)SNAP25的單克隆抗體，可以作為檢測抗體用于肉毒毒素活性的檢測。

本研究中我們表達(dá)并純化了SNAP25蛋白，將其作為免疫原免疫小鼠，利用雜交瘤技術(shù)制備鼠單抗。經(jīng)過2輪篩選獲得12株陽性雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)鑒定選擇14號(hào)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗體的大量制備，純化后獲得高純度的單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡BALB/c小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生化科技有限公司；pET30a-SNAP25質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；弗氏完全、不完全佐劑，TMB顯色液購自Sigma公司；DMEM購自Cellmax公司；HAT、胎牛血清購自Gibco公司；PEG1500購自Roche公司；Ni2+-IDA HP、HiTrap Protein G HP購自GE公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗購自Thermo公司；抗體亞型鑒定試劑盒購自北京博奧龍免疫技術(shù)公司；96孔酶標(biāo)板購自NEST公司。

1.2 制備抗原SNAP25

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-SNAP25轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)；挑取平板上的單克隆接種至5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；次日按1∶100接種至200 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至D600nm為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，15℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)；4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，菌體沉淀用結(jié)合緩沖液（20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪 唑 ，1% TritonX-100，2mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，pH7.2）重懸，超聲波破碎菌體；4℃、12 000 r/min離心10 min收集上清，上樣至已用結(jié)合緩沖液平衡過的Ni2+-IDA親和層析柱，再用含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，收集各階段的洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3 小鼠免疫及效價(jià)檢測

選取4只SPF級(jí)6～8周齡雌性BALB/c小鼠，編號(hào)1～4。初次免疫每只小鼠經(jīng)皮下注射60 μg SNAP25蛋白。具體地，將240 μg SNAP25蛋白用PBS稀釋后加入等體積弗氏完全佐劑，充分混勻直至形成穩(wěn)定的油包水型乳劑，在每只小鼠背部選取5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，0.2 mL/點(diǎn)；之后每隔2周重復(fù)免疫1次（佐劑換為弗氏不完全佐劑），共4次，免疫量為30 μg蛋白/只；第4次免疫7 d后對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶取血，全血于室溫靜置30 min，4℃、3000 r/min離心10 min收集血清，間接ELISA法測定血清效價(jià)。具體地，用2 μg/mL的SNAP25抗原包被96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，4℃包被過夜，PBS-T洗3次；用2%脫脂牛奶于37℃封閉2 h，PBS-T洗3次；血清用封閉液按1∶200稀釋作為起始濃度，再按照1∶2梯度稀釋共10個(gè)濃度，分別取100 μL加入96孔酶標(biāo)板，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗按1∶50 000稀釋，取100 μL加入96孔酶標(biāo)板，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；每孔加入100 μL TMB顯色液，避光顯色5 min，加入終止液，酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.4 細(xì)胞融合

對(duì)血清效價(jià)最高的小鼠通過腹腔注射200 μg SNAP25蛋白進(jìn)行抗原沖擊，3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合。融合當(dāng)天，將小鼠摘眼球取血（制備血清留作陽性對(duì)照）后斷頸處死，在75%酒精中浸泡5 min；無菌條件下分離小鼠脾臟和胸腺，先將胸腺用注射器內(nèi)芯研碎后加入1 mL HAT，轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管，放入培養(yǎng)箱備用；將脾臟充分研磨后過細(xì)胞篩，用少量無血清DMEM沖洗后加入50 mL離心管，1500 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用DMEM重懸，反復(fù)清洗3次后用DMEM調(diào)整脾細(xì)胞數(shù)目為108左右；將生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞用DMEM清洗2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為107左右（脾細(xì)胞∶Sp2/0細(xì)胞=10∶1）；將脾細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞加入50 mL離心管后混勻，1500 r/min離心5 min，小心棄上清，輕彈離心管底部使細(xì)胞松散；將離心管置于37℃溫水中，1 min內(nèi)緩慢加入1 mL PEG1500，邊加邊輕輕搖動(dòng)，加完后靜置90 s；在1 min內(nèi)均勻加入1 mL DMDM，然后在2 min內(nèi)均勻加入4 mL DMDM，800 r/min離心3 min；小心棄上清，用20 mL胎牛血清輕輕重懸細(xì)胞沉淀，加入準(zhǔn)備好的胸腺細(xì)胞，混勻；同時(shí)準(zhǔn)備30 mL經(jīng)高壓滅菌的半固體培養(yǎng)基，倒入含胸腺細(xì)胞的離心管中，上下顛倒混勻；均勻倒入25個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 陽性雜交瘤細(xì)胞篩選

融合的細(xì)胞用半固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)2周后，挑取細(xì)胞培養(yǎng)皿上的單克隆接種到96孔板（板中提前加入胸腺細(xì)胞，100 μL/孔），93個(gè)克隆/板，共挑取10塊96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3 d后，利用ELISA對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行第1輪篩選。具體地，將96孔酶標(biāo)板用2 μg/mL SNAP25抗原包被，100 μL/孔，4℃包被過夜，PBS-T 洗3次；用 2%脫脂牛奶作為封閉液，200 μL/孔，37℃封閉2 h，PBS-T洗3次；將雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗加入96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（Sp2/0培養(yǎng)上清）、空白對(duì)照（PBS）和陽性對(duì)照（陽性血清用PBS按1∶1000稀釋），37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗用PBS按1∶20 000稀釋后加入酶標(biāo)板，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；加入TMB顯色液，100 μL/孔，顯色5 min；加入終止液，50 μL/孔，酶標(biāo)儀讀取D450nm值，記錄保存數(shù)據(jù)。

對(duì)于第1輪篩選得到的陽性雜交瘤細(xì)胞，2 d后按照相同方法進(jìn)行第2輪篩選，2輪篩選后得到的陽性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后及時(shí)凍存。

1.6 抗體亞型分析

取陽性雜交瘤細(xì)胞上清，利用抗體亞型鑒定試劑盒鑒定抗體亞型。

1.7 抗體大量制備及純化

選取2只8～10周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射0.5 mL滅菌的液體石蠟；1周后取0.5 mL密度為2×106/mL的雜交瘤細(xì)胞懸液，通過腹腔注射接種到小鼠腹腔內(nèi)，誘發(fā)小鼠產(chǎn)生腹水；10～14 d后小鼠腹部明顯膨大，用注射器抽取腹水，12 000 r/min離心20 min去除血脂和其他雜質(zhì)，收集上清加入等體積結(jié)合緩沖液混勻，上樣至用結(jié)合緩沖液平衡過的HiTrap Protein G親和層析柱，平衡至基線后用洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫組分，利用SDS-PAGE檢測抗體純度。

2 結(jié)果

2.1 抗原SNAP25的純化

將重組質(zhì)粒pET30a-SNAP25轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），在IPTG終濃度為0.1 mmol/L、于15℃誘導(dǎo)16 h的條件下，實(shí)現(xiàn)了SNAP25蛋白的可溶性表達(dá)，表達(dá)量約占全菌蛋白的26%。表達(dá)菌pET30a-SNAP25/BL21（DE3）經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后超聲波破碎，取上清液用Ni2+-IDA親和層析柱純化，用含不同濃度咪唑的洗脫液洗脫，洗脫組分經(jīng)SDSPAGE分析，在相對(duì)分子質(zhì)量約25 000處可見特異性蛋白條帶（圖1），分子大小與目的蛋白的理論值相符。利用Gelpro32軟件分析，SNAP25蛋白的純度大于90%。

圖1 SNAP25蛋白純化的SDS-PAGE分析

2.2 小鼠血清效價(jià)

通過皮下注射SNAP25抗原對(duì)4只BALB/c小鼠進(jìn)行4次免疫，第4次免疫7 d后眼眶取血收集血清，間接ELISA法檢測血清效價(jià)，結(jié)果1～4號(hào)小鼠血清效價(jià)依次為6400、3200、3200、1600，1號(hào)小鼠血清效價(jià)最高，因此選取1號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

2.3 陽性雜交瘤細(xì)胞篩選

融合后的細(xì)胞利用半固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取細(xì)胞單克隆接種至96孔板，培養(yǎng)后取細(xì)胞上清利用ELISA對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行第1輪篩選，得到21株陽性雜交瘤細(xì)胞，編號(hào)1～21。采用相同方法對(duì)這21株陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行第2輪篩選，結(jié)果如圖2，最終得到12株陽性雜交瘤細(xì)胞株（D450nm大于陰性對(duì)照5倍以上）。其中14號(hào)雜交瘤細(xì)胞株具有相對(duì)較高的抗原結(jié)合活性，因此選擇14號(hào)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗體的大量制備。

圖2 陽性雜交瘤細(xì)胞第2輪篩選

2.4 抗體亞型分析

對(duì)篩選得到的12株陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行抗體亞型鑒定，確定這12株陽性雜交瘤細(xì)胞抗體的重鏈除3株為IgG2型外，其余均為IgG1型；輕鏈除2株為λ鏈外，其余均為κ鏈（表1）。

表1 12株陽性雜交瘤細(xì)胞抗體亞型

2.5 抗體純化

用14號(hào)雜交瘤細(xì)胞株制備小鼠腹水，收集腹水離心取上清，采用HiTrap Protein G親和層析柱純化，SDS-PAGE檢測抗體純度。在相對(duì)分子質(zhì)量約55 000和25 000處可見2條特異性條帶（圖3），分子大小分別與抗體重鏈、輕鏈的理論值相符。利用軟件Gelpro32分析，抗體純度大于90%。

圖3 SNAP25抗體純化的SDS-PAGE分析

3 討論

本研究中我們利用雜交瘤技術(shù)制備針對(duì)SNAP25的單克隆抗體，以大腸桿菌表達(dá)的SNAP25蛋白作為免疫原對(duì)4只BALB/c小鼠進(jìn)行了5次免疫，選取其中血清效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，融合的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過2輪篩選，獲得12株陽性雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)ELISA檢測，選擇抗原結(jié)合活性較高的14號(hào)細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后注射到小鼠腹腔內(nèi)誘發(fā)腹水產(chǎn)生，小鼠腹水經(jīng)過親和純化，最終獲得1株高純度的單克隆抗體。

肉毒毒素是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的蛋白毒素，在人體中可以引發(fā)肉毒中毒。肉毒毒素共有40多種亞型，根據(jù)其毒性及抗原性的差異，主要分為A～G共7種血清型。其中A、B、E、F型容易引發(fā)人類肉毒中毒，C、D型主要引發(fā)動(dòng)物肉毒中毒，G型則比較少見[7]。肉毒毒素是雙鏈蛋白質(zhì)，由通過二硫鍵連接的相對(duì)分子質(zhì)量約100 000的重鏈（HC）和約50 000的輕鏈（LC）組成。肉毒毒素的重鏈C端包含受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠與位于神經(jīng)元細(xì)胞膜表面的神經(jīng)節(jié)苷脂受體及某些特定蛋白質(zhì)結(jié)合，通過內(nèi)吞作用將輕鏈運(yùn)送至胞內(nèi)[8]。輕鏈?zhǔn)墙柚赯n2+的蛋白酶[9]，通過在神經(jīng)肌肉接頭處切割SNAP25發(fā)揮作用。肉毒毒素的多種血清型都可以通過靶向參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的胞吐過程的SNAP25蛋白，達(dá)到抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的作用。例如，A型肉毒毒素（BoNT/A）的輕鏈在氨基酸殘基Gln197和Arg198之間切割SNAP25；E型肉毒毒素（BoNT/E）的輕鏈在氨基酸殘基Arg180和Ile181之間切割SNAP25；C1型肉毒毒素（BoNT/C1）的輕鏈在氨基酸殘基Arg198和Ala199之間切割SNAP25[10]。BoNT/A的輕鏈切割SNAP251-206后形成產(chǎn)物SNAP251-197，同時(shí)暴露出原先包埋于C端α螺旋內(nèi)部的八肽抗原表位[11]。通過檢測此八肽抗原，可以進(jìn)行肉毒毒素活性的定性或定量測定。

我們制備了針對(duì)SNAP25的單克隆抗體，目前正在制備針對(duì)SNAP25的肉毒毒素切割產(chǎn)物的特異性抗體，可以將二者結(jié)合通過夾心ELISA檢測肉毒毒素對(duì)SNAP25的切割活性，取代傳統(tǒng)上檢測肉毒毒素活性的小鼠生物測定法。此外，由于SNAP25對(duì)于調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放及軸突生長具有重要作用，本研究制備的抗體可望用于人或動(dòng)物大腦等組織中SNAP25表達(dá)水平的檢測，有助于推動(dòng)SNAP25在神經(jīng)傳導(dǎo)中的機(jī)制研究。