謝宇鋒，余云進，楊錦蘭，陳 赟，馮 軍△，楊宗保

(1.廣州中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510000；3.廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門 361005)

胃熱證以胃脘灼痛、燒心為主要癥狀，是胃脘痛的常見證型之一。胃熱證主要是飲食不節(jié)如嗜食辛辣、飲酒過度等，而致胃氣壅滯，熱毒內(nèi)蘊，熱毒之邪易于造成胃絡(luò)損傷、氣血凝滯，繼而血敗肉腐，發(fā)為糜爛潰瘍。有相關(guān)的研究表明,胃熱證、無明顯寒熱證、胃寒證胃病患者胃黏膜炎癥程度依次減輕[1]。因此，胃黏膜損傷是胃熱證的主要病理變化。故本課題組采用基于嗜食辛辣厚味的飲食不節(jié)方法復制胃熱證大鼠模型，研究艾灸胃經(jīng)穴對胃熱證大鼠胃黏膜的修復作用，探討“熱證可灸”的作用機制及其科學性。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠70只，體質(zhì)量(150±20)g，購自吳氏實驗動物中心[動物合格證號：SCXK(浙)170803004]，在廈門大學動物實驗中心(SPF)分組飼養(yǎng)，控制室溫22℃，相對濕度60%，自然光暗周期。

1.2 藥物和試劑

1.2.1 藥物及試劑來源 艾條選用清艾條(江蘇康美制藥有限公司，國藥準字Z32020253)；無水乙醇(廣州威佳科技有限公司，純度為分析純，批號:20170902-2)；辣椒素(北京百靈威科技有限公司，批號：LCCOQ91；純度：98%)。

1.2.2 藥品及試劑制備 ①乙醇溶液的制備:第1周量取30 mL無水乙醇加入270 mL純水，從而制備10%的乙醇水溶液，之后每周濃度提高10%，直至第4周乙醇濃度達到40%，第5周仍保持乙醇濃度為40%；②辣椒素和乙醇溶液制備:第1次稱取0.15 g辣椒素，由于辣椒素不溶于水，需先將辣椒素溶解150 mL無水乙醇中，然后加入350 mL純水，此時辣椒素質(zhì)量濃度為0.2 g/L，之后每日辣椒素質(zhì)量濃度提高0.05 g/L，直至質(zhì)量濃度達到 0.9 g/L;③灌胃冰水制備: 常規(guī)冰水混合物溫度為0℃，可將冰塊與水按質(zhì)量比約為2∶1進行混合，放置20 min后可基本達到該溫度;④泡浴涼水制備: 本研究所取涼水溫度為10℃，且用水量較大，需在盛裝8 L水后，放入冰塊若干，使水溫維持于10℃。

2 方法

2.1 實驗分組

70只Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為7組，每組10只，分別為：正常組、胃熱證組、胃熱艾灸組、胃熱艾灸對照組、胃寒證組、胃寒艾灸組、胃寒艾灸對照組。

2.2 模型復制方法

2.2.1 胃熱證造模 參照楊萬斌等[2]報道的胃熱證大鼠模型復制方法，造模周期為5周，前3周用乙醇溶液每日灌胃2次(10 mL/kg)，后2周給予辣椒素和乙醇溶液每日灌胃2 次(10 mL/kg)，并于灌胃后以該溶液1 mL注入大鼠口腔中給予味覺刺激。

2.2.2 胃寒證造模 參照楊萬斌等[3]報道的胃寒證大鼠模型復制方法，給予冰水灌胃每日3次，并予以10℃涼水泡浴每日1次，15 min/次，泡浴后取出動物，吹風機吹干，標準條件下飼養(yǎng)，持續(xù)5周。

2.3 干預方法

正常組、胃熱證組、胃寒證組:標準飼養(yǎng)，正常組不造模，胃熱證組、胃寒證組分別復制胃熱證、胃寒證大鼠模型，模型復制方法同上，不艾灸，采用鼠板固定30 min/次，1次/天，連續(xù)干預12天。

胃熱艾灸組、胃寒艾灸組:標準飼養(yǎng)，各組在造模結(jié)束后第2天即鼠板固定，艾灸胃經(jīng)梁門、足三里穴，30 min/次，1次/天，連續(xù)干預12天。

胃熱艾灸對照組、胃寒艾灸對照組:標準飼養(yǎng)，各組在造模結(jié)束后第2日即鼠板固定，艾灸與胃經(jīng)梁門、足三里穴同水平，位于足陽明胃經(jīng)與足少陽膽經(jīng)之間的非經(jīng)非穴點，30 min/次，1次/天，連續(xù)干預12天。

2.4 艾灸方法

2.4.1 取穴方法 取穴方法參照李忠仁《實驗針灸學》[4]：梁門：腹正中線與鎖骨中線之間的中線上，臍(根據(jù)類比原理，在大鼠胸腹正中線，胸骨柄上緣至外生殖器連線的上3/4與下1/4交界處)上4寸；足三里：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處。非經(jīng)非穴點即為與胃經(jīng)梁門、足三里穴同水平，位于足陽明胃經(jīng)與足少陽膽經(jīng)之間的非經(jīng)非穴點。

2.4.2 操作方法 大鼠成功造模后采用溫和灸，取穴定位后剪毛, 將隔熱貼剪3 mm孔, 貼于穴位上, 將車載軟臂手機支架固定實驗臺上，將艾條固定在支架尾端的夾子上,兩側(cè)各距同側(cè)穴位約5 mm,局部艾灸溫度控制在42℃左右。每次艾灸30 min，1次/天，連續(xù)干預12天，各組每日處理后松綁, 回籠正常飼養(yǎng)。

2.5 動物處理及標本采集

各組大鼠在治療結(jié)束后,所有動物禁食不禁水，24 h后2%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后斷頭取腦，并分離大腦皮質(zhì)和取出全胃，沿胃大彎剪開胃壁，并用冰生理鹽水沖去胃黏膜表面的食物殘渣，并將全胃展開平鋪于冰盤上，行胃黏膜損傷指數(shù)評分，用手術(shù)刀片刮取病變部位周圍胃竇部黏膜組織。將分離所得的大腦皮質(zhì)和胃竇部黏膜組織分別置于凍存管后在液氮中凍存30 s，并保存于-80℃冰箱中。

2.6 檢測指標及方法

2.6.1 一般行為學觀察 ①精神及活動狀態(tài)：精神狀態(tài)良好，活潑好動，或者躁動、興奮，或者踡縮,懶動；②毛發(fā)情況：觀察大鼠的毛發(fā)光澤、濃密程度以及皮膚彈性等；③大便性狀：觀察大鼠大便的性狀(軟爛、軟、適中、硬)、顏色(黃、黃褐、黑褐)；④大鼠外觀：舌唇顏色(青紫、蒼白、淡紅、紅、紅紫)、耳廓(紅、蒼白、粉紅)。

2.6.2 胃黏膜大體形態(tài)損傷及評分觀察 各組大鼠完成一般情況觀察后斷頭處死，取胃，摘出全胃，沿大彎側(cè)剪開，充分暴露胃黏膜，采用Guth法[5]計算胃黏膜損傷指數(shù)，全胃各病灶的長度按下面標準評分后的和為損傷指數(shù)，損傷寬度<1 mm(包括糜爛、出血點)為1分,1 mm<損傷寬度<2 mm為2分，依次類推，損傷寬度>2 mm者,指數(shù)加倍。

2.6.3 胃黏膜組織病理學觀察 取胃竇部1 cm×0.5 cm大小的組織塊，采用生理鹽水沖洗干凈，將標本放入 10%的甲醛溶液中固定24～48 h，并進行梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，二甲苯透明，切片。HE染色后光鏡下觀察胃黏膜組織病理學改變[6]。使用MoticTek3.1圖像采集系統(tǒng)行電腦圖像攝像。

2.6.4 胃黏膜組織中相應(yīng)靶標蛋白的表達量觀察 Western Blotting檢測21例組織樣本中NT、survivin的相對表達量。每例組織樣本各個靶標蛋白檢測取約30 μg組織蛋白樣品，加入4×loading buffer，沸水浴10 min，10 000 rpm離心10 min；根據(jù)蛋白分子量制備12%或15%的SDS-PAGE膠進行電泳分離蛋白樣品；將SDS-PAGE膠上的蛋白通過電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將PVDF浸泡在含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫孵育1 h；PBST洗膜，3×5 min；加入相應(yīng)的一抗， 4 ℃過夜；PBST洗3次，每次20 min；加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液，室溫孵育1 h；PBST洗3次，每次10 min；將PVDF膜與新鮮配制的增強型化學發(fā)光劑(ECL)溶液反應(yīng)2 min，快速于暗室中曝光顯影。

2.7 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般行為學觀察比較

正常組：一般狀態(tài)良好,活潑好動、毛發(fā)光亮、濃密,皮膚彈性良好,飲食正常,大便成形,籠內(nèi)墊料可長時間保持干爽清潔;胃熱證組：胃熱證模型大鼠表現(xiàn)為躁動、興奮，大便呈顆粒狀，質(zhì)地干硬，舌唇耳廓色紅;胃熱艾灸組：大鼠躁動、興奮，大便干硬較模型組有所好轉(zhuǎn)，舌唇耳廓色紅,較胃熱證組變淡;胃熱艾灸對照組：大鼠的一般行為學與胃熱證組比較改變不明顯;胃寒證組:胃寒證模型大鼠表現(xiàn)為精神不振,踡縮,懶動,行動遲緩,不喜爭斗, 體毛豎立且無光澤,大便稀溏,量多,舌唇色蒼白;胃寒艾灸組：大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，顯得較活潑好動，大便質(zhì)軟形成，舌唇色淡紅;胃寒艾灸對照組：大鼠精神狀態(tài)較前稍好轉(zhuǎn)，但是大便性狀改變不明顯。

3.2 艾灸對胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復肉眼觀察比較

正常組大鼠胃黏膜皺襞完整，無破損，呈淡紅色，表面光滑色澤明亮，未見充血出血點；胃熱證組大鼠皺襞破損，可見黏膜充血明顯，胃體表面有斑點狀潰瘍、糜爛點，出血處顏色晦暗；胃熱艾灸組皺襞破損較胃熱證組有所恢復，有少量出血點，充血緩解；胃熱艾灸對照組與胃熱證組無明顯差異。

3.3 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)比較

研究結(jié)果顯示,各組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗均符合正態(tài)性分布，但是經(jīng)方差齊性檢驗提示方差不齊，故采用 Tamhane T2 法進行方差檢驗和兩兩比較，與正常組相比較，胃熱證組和胃寒證組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯升高(P<0.05)；與胃熱證組比較，胃熱艾灸組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯降低(P<0.05)，胃熱艾灸對照組的胃黏膜損傷指數(shù)未見明顯改變(P>0.05)；與胃寒證組比較，胃寒艾灸組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯降低(P<0.05)，胃寒艾灸對照組的胃黏膜損傷指數(shù)未見明顯改變(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)的比較分)

注：與正常組比較,aP<0.05；與胃熱證組比較,bP<0.05；與胃寒證組比較，dP<0.05;與胃熱艾灸組比較,cP<0.05;與胃寒艾灸組比較，eP<0.05。

3.4 各組大鼠胃黏膜損傷修復的病理學比較

正常組：可見胃黏膜層由黏膜下層、肌層及漿膜層組成，結(jié)構(gòu)清晰，層次分明；胃熱證組和胃寒證組可見黏膜壞死脫落，潰瘍形成，間質(zhì)出現(xiàn)水腫，細胞間隙增寬明顯，炎細胞浸潤廣泛；胃熱艾灸組和胃寒艾灸組可見胃黏膜淺層有細胞脫落，無明顯潰瘍形成；胃熱艾灸對照組和胃寒艾灸對照組胃黏膜組織病理學表達與胃熱證組和胃寒證組基本相同。見封三彩圖1。

3.5 各組大鼠胃黏膜組織中靶效應(yīng)蛋白的表達量比較

在胃熱模型中，與正常組相比，胃熱證組中NT的表達有一定程度下調(diào)(P<0.05)，艾灸處理后，與胃熱證組比，胃熱艾灸對照組表達無明顯變化(P>0.05)，而胃熱艾灸組表達量升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；survivin的表達，與正常組相比，胃熱證組中survivin的表達下調(diào)(P<0.05)，艾灸處理后，胃熱艾灸組和胃熱艾灸對照組survivin的表達均有所升高(P<0.05)，且胃熱艾灸組升高比胃熱艾灸對照組明顯。見圖2～3。

在胃寒模型中，與正常組相比，胃寒證組中NT和survivin的表達均有所下調(diào)(P<0.05)，艾灸處理后，與胃寒證組比較，胃寒艾灸對照組NT和survivin的表達未見明顯上調(diào)，而胃寒艾灸組NT和survivin的表達均上調(diào)(P<0.05)。見圖4～5。

注:Z.正常組，R.胃熱證組，A.胃熱艾灸對照組，C.胃熱艾灸組。圖2 胃熱模型中胃黏膜組織中靶效應(yīng)蛋白的表達情況比較

注:Z.正常組，R.胃熱證組，A.胃熱艾灸對照組，C.胃熱艾灸組;與Z比較，*P<0.05；與R比較，#P<0.05。圖3 胃熱模型中胃黏膜組織中靶效應(yīng)蛋白的相對表達量對比

注:Z.正常組，H.胃寒證組，B.胃寒艾灸對照組，D.胃寒艾灸組。圖4 胃寒模型中胃黏膜組織中靶效應(yīng)蛋白的表達情況對比

注:Z.正常組，H.胃寒證組，B.胃寒艾灸對照組，D.胃寒艾灸組;與Z比較，*P<0.05;與H比較，#P<0.05。圖5 胃寒模型中胃黏膜組織中靶效應(yīng)蛋白的相對表達量對比

4 討論

“熱證可灸”是針灸學的經(jīng)典理論，是指使用艾灸來治療病性屬熱的證候。清代醫(yī)家吳師機在《理瀹駢文·續(xù)增略言》中記載:“若夫熱證亦可以用熱者，一則得熱則行也，一則以熱引熱使熱外出也，即從治之法也”。歷代醫(yī)家對“熱證施灸”不僅停留在理論的探討層面，還進行臨證實踐，在運用灸法治療臟腑實熱證方面記載頗豐，如熱在臟施灸者，《千金要方》云:“治五藏熱及身體熱，脈弦急者，灸節(jié)十四椎與臍相當五十壯”，又云：“治心實熱，不能食，胸中滿隔上逆氣悶熱，灸心俞二七壯”；熱在腑施灸，《針灸大成》曰：“赤痢，灸小腸俞”?！锻馀_秘要》也曾引《古今驗錄》云：“治熱結(jié)小便不通利方……取鹽填滿臍中，作大艾炷，令熱為度良”?！肚Ы鹨矸健犯敲鞔_指出：“胃中熱，灸三里三十壯”。由此可見，艾灸用于熱證的治療不僅有深厚的中醫(yī)學理論基礎(chǔ)，而且具有豐富的臨床實踐經(jīng)驗。

本課題組在早期的研究也發(fā)現(xiàn)艾灸胃經(jīng)穴可特異性地降低胃黏膜損傷大鼠的胃黏膜損傷指數(shù)，增加胃黏膜血流量，增強胃黏膜相關(guān)信號蛋白質(zhì)的表達，從而防治胃黏膜損傷相關(guān)疾病，如胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎等[7-11]。國內(nèi)學者陳果等[12]研究發(fā)現(xiàn),艾灸足三里可以明顯改善胃黏膜損傷大鼠的胃黏膜組織形態(tài), 降低胃黏膜損傷指數(shù)，該作用可能與調(diào)節(jié)血清與組織中EGF、PGE2含量以及胃黏膜組織Bcl-2/Bax比例有關(guān)，但該作用受腓總神經(jīng)通路破壞而干擾。陳慧娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，艾灸胃經(jīng)穴可以明顯上調(diào)應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃黏膜的損傷指數(shù)，該作用可能與上調(diào)胃黏膜細胞的Bcl-XL、Mcl-1、Bcl-2及IAPs 410等10種蛋白質(zhì)磷酸化水平，下調(diào)TNF、Fas、Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9及Bax 6等18種蛋白質(zhì)磷酸化水平有關(guān)，且該作用存在臟腑經(jīng)脈的特異性。粟艷梅等[14]研究發(fā)現(xiàn),艾灸足三里等穴位可以促進脾虛型胃潰瘍大鼠胃黏膜損傷的修復，該作用可能與通過促進內(nèi)源性保護蛋白MT的含量及HSP 70的表達而實現(xiàn)的。劉密等[15]研究發(fā)現(xiàn),艾灸足三里等穴位預處理可以減輕應(yīng)激性潰瘍大鼠的胃黏膜損傷指數(shù)，該作用可能與上調(diào)血清保護因子(PGE2、CGRP、MT和HSP 70)而達到其保護胃黏膜的作用有關(guān)。大量的研究證實，艾灸作用于穴位可以調(diào)節(jié)機體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能，實施對胃黏膜損傷的修復作用。然而，艾灸是否對胃熱證大鼠胃黏膜損傷同樣具有修復作用，則未見相關(guān)報道。為了從實驗的層面證實“熱證可灸”的可行性和科學性，本課題組以胃熱證大鼠為切入，觀察艾灸胃經(jīng)穴對胃熱證大鼠胃黏膜損傷的修復作用，具體研究結(jié)果如下。

實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，胃熱證模型組大鼠躁動、興奮，胃寒證模型組精神不振、踡縮、懶動等，胃熱證模型組和胃寒證模型組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯升高(P<0.05)，胃黏膜組織病理學觀察可見黏膜壞死脫落，潰瘍形成，間質(zhì)出現(xiàn)水腫，細胞間隙增寬明顯，炎細胞浸潤廣泛；與模型組比較，胃熱艾灸組可以改善大鼠躁動、奮興等胃熱證的證候，胃寒艾灸組可以改善大鼠精神不振、踡縮、懶動等胃寒證的證候，胃熱艾灸組和胃寒艾灸組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯下降(P<0.05)，胃熱艾灸組和胃寒艾灸組的胃黏膜組織病理學觀察可見胃黏膜淺層有細胞脫落，無明顯潰瘍形成；胃熱艾灸對照組和胃寒艾灸對照組無論在一般行為學的證候方面，還是在胃黏膜損傷指數(shù)和組織病理學方面均未見明顯變化。

NT[16]對胃黏膜的完整性發(fā)揮重要的作用，既保護胃黏膜又參與潰瘍的形成[17]。NT可抑制胃酸、胃蛋白酶分泌，刺激胃黏膜PG和NO釋放，增強胃黏膜對損傷的抵抗力[18]。Survivin又名生存素，屬于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptos is protein,IA)[19],可調(diào)節(jié)細胞增殖，抑制細胞凋亡，誘導血管生成等生物活性[20]。多數(shù)研究顯示主要在腫瘤組織中發(fā)揮抗細胞凋亡的作用，在正常器官組織中無表達，但譚愛國等[21]提出在正常胃黏膜組織中亦有表達。陳敏敏[22]的研究與譚愛國的實驗結(jié)果相同，并且發(fā)現(xiàn)人體正常胃黏膜組織中含量隨年齡明顯降低，結(jié)合Survivin廣譜的抗調(diào)亡細胞作用，提示正常胃黏膜組織中的抗細胞調(diào)亡的作用隨齡降低。本研究表明，胃熱證組和胃寒證組大鼠的胃黏膜細胞中NT和Survivin的表達下降，說明胃熱證、胃寒證大鼠的胃黏膜損傷可能與上述兩種靶效應(yīng)蛋白下調(diào)，導致其對損傷的抵抗力和抑制細胞凋亡作用下降有關(guān)，艾灸胃經(jīng)穴可以上調(diào)胃黏膜細胞中NT和Survivin的水平，而艾灸對照組則未見明顯變化，說明NT和Survivin可能是艾灸調(diào)控胃熱證和胃寒證大鼠胃黏膜損傷修復的靶效應(yīng)蛋白，且穴位具有特異性。

本研究在一定程度上證明了艾灸胃經(jīng)穴可以促進胃熱證大鼠胃黏膜的損傷修復，該作用與胃寒證大鼠作用相當，說明“熱證可灸”具有科學性，本研究為臨床艾灸干預胃熱證提供實驗依據(jù)，并在一定程度上闡述了其產(chǎn)生作用的可能效應(yīng)蛋白，對于揭示胃黏膜損傷疾病的艾灸治療作用具有創(chuàng)新意義。