徐藝菲，殷 磊，侯中偉

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

慢性腎功能衰竭(Chronic renal failure ，CRF)簡稱慢性腎衰，是在慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)基礎(chǔ)上出現(xiàn)腎功能進行性減退直至衰竭的一種臨床綜合癥[1]，是多種慢性腎臟及與腎臟有關(guān)疾病的最終歸宿，預后不良，是威脅人類健康和生命的重要疾病之一[2-3]。中國首個慢性腎臟病流行病學的多中心調(diào)查結(jié)果顯示我國慢性腎臟病總患病率為10.8%，以此估計中國有將近1.195億CKD患者[4]。腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是導致CRF的病理學基礎(chǔ)，是各種慢性、進展性腎臟疾病的最終歸宿，其嚴重程度與腎功能的損壞程度密切相關(guān)。研究采用腺嘌呤灌胃法建立慢性腎衰大鼠模型[5]，傳統(tǒng)針刺作為治療手段，觀察其對模型大鼠血液中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及腎間質(zhì)纖維化相關(guān)指標TGF-β1的影響，探究針刺“腎俞”穴對慢性腎衰竭的治療效果，以拓寬CRF的治療思路和豐富CRF的治療手段，

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXX京2016-0006)。動物按照隨機數(shù)字表法分為正常組、模型對照組和針刺組，為減少數(shù)據(jù)脫落對數(shù)據(jù)造成的影響，正常組為10只大鼠，模型組和針刺組分別為15只大鼠，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所，環(huán)境溫度為20～25℃，濕度為55%左右。

1.2 藥品、試劑和設備

腺嘌呤(Bioruler，批號:RH49540)，水合氯醛(Bioruler，批號:RH32027);一次性無菌針灸針(漢醫(yī)，型號:18 mm×13 mm);尿素測定試劑盒(貝克曼庫爾特，批號：AUZ4812);肌酐測定試劑盒(貝克曼庫爾特，批號：AUZ4580);TGF-β1抗體(Affinity，AF1027);全自動生化分析儀(BECKMAN COULTER，型號:AU480);半自動石蠟切片機(萊卡，型號：RM2245);全自動脫水機(萊卡，型號：ASP200S);自動包埋機(萊卡，型號：EG1150)。

1.3 慢性腎衰模型的制備方法

本實驗采用腺嘌呤灌胃法進行造模，大鼠適應性飼養(yǎng)5天后，將腺嘌呤與蒸餾水混合制成0.25%的腺嘌呤混懸液，按照200 mg/kg/d的劑量每日對大鼠進行灌胃，連續(xù)28天。

1.4 各組大鼠干預方法

正常組：正常飼養(yǎng)。

模型組：每日上午腺嘌呤灌胃造模。

針刺組：在造模開始的同時進行治療，每日上午腺嘌呤灌胃, 下午使大鼠鉆入自制鼠套，使用針灸針對雙側(cè)“腎俞”穴(取穴方法參照《實驗針灸學》[6])毫針直刺，進針6 mm，留針30 min。

1.5 一般指標觀察

每日觀察各組大鼠精神、飲食、飲水、皮毛色澤、活動情況及墊料干濕程度并記錄，每周稱取大鼠體重，實驗結(jié)束后稱取大鼠腎臟濕重。

1.6 血液指標檢測

實驗結(jié)束后，采用10%的水合氯醛按照0.3 mL/100 g的劑量對大鼠進行麻醉，經(jīng)大鼠心臟取血2 mL，于室溫靜置2 h后，以3 000 r/min離心10 min，取200 μL血清放入凍存管，采用BECKMAN COULTER全自動生化分析儀進行血常規(guī)及生化檢測。

1.7 TGF-β1免疫組化染色

大鼠腎臟切片脫蠟至水，過氧化氫封閉10 min，高壓抗原修復，加羊血清封閉，然后直接滴加TGF-β1一抗(濃度為1：100)，4℃過夜；次日，PBS緩沖液洗滌后；加二抗，37℃孵育30 min，然后DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。光學顯微鏡下觀察陽性顆粒表達情況并拍照。采用AJ-VERT imaging system0及Image Pro Plus 32 analysis system進行計算，每張切片采取5個隨機視野，每個視野獨立計算。

1.8 HE染色

大鼠取血后迅速取出大鼠雙側(cè)腎臟放入10%福爾馬林固定，之后進行石蠟包埋，半自動切片機切成5 μm組織片，然后組織片進行常規(guī)脫蠟；梯度乙醇水化100%—90%—80%—70%; 蘇木素染液10 min；酸酒精分色2 s；1%伊紅染液1 min； 去離子水稍水洗；梯度乙醇脫水；70%—80%—90%—100%;二甲苯透明；中性樹膠固封。光學顯微鏡下觀察組織病變并拍照。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

實驗過程中模型組大鼠因灌胃不當死亡1只，故樣本數(shù)量少于初始數(shù)量。

2.1 各組一般形態(tài)學情況對比

實驗開始第1周，各組大鼠均毛色光亮，活動靈敏，對聲音和燈光敏感。從第2周開始，模型組和針刺組大鼠毛色開始稍顯暗淡，出現(xiàn)喜蜷喜臥，飲水量增加，墊料潮濕速度加快，以上現(xiàn)象均呈進行性加重，兩組中模型組更為明顯，而針刺組大鼠經(jīng)過4周治療后，喜蜷喜臥等現(xiàn)象均優(yōu)于模型組。

2.2 各組大鼠腎臟指數(shù)、血清肌酐和尿素氮比較

與正常組相比，模型組大鼠的腎臟指數(shù)(腎臟體重比)、Scr和BUN 含量顯著升高(P<0.05)。與模型組大鼠相比，針刺組大鼠的腎臟指數(shù)、Scr及BUN顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腎臟指數(shù)、Scr、BUN的比較

注：與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

2.3 各組大鼠TGF-β1表達情況比較

與正常組相比，模型組大鼠腎組織中TGF-β1表達明顯增多(P<0.05)。與模型組相比，針刺組大鼠的TGF-β1表達明顯降低(P<0.05)。見圖1。

注：與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖1 各組大鼠TGF-β1平均光密度值比較

2.4 各組大鼠HE染色結(jié)果

正常組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)完整，腎小球未見萎縮，腎小管、集合管未見擴張或萎縮，無纖維組織增生和炎細胞浸潤。模型組大鼠腎小管黃綠色結(jié)晶沉積及肉芽腫形成、腎小管擴張、腎小管變性/壞死、間質(zhì)炎細胞浸潤及間質(zhì)纖維化。針刺組大鼠腎小管管腔內(nèi)未見黃綠色結(jié)晶體，腎小管擴張、腎小管變性/壞死病變及纖維化均有減輕趨勢。見封三彩圖2。

3 討論

中醫(yī)古代文獻中并無與慢性腎功能衰竭相對應的中醫(yī)病名，慢性腎功能衰竭臨床癥狀繁多，病因病機復雜，根據(jù)其臨床表現(xiàn)及發(fā)展過程，當屬中醫(yī)文獻中的水腫、癃閉、關(guān)格、腎勞、腎風、腎痿、溺毒、虛勞等病證范疇。眾多醫(yī)家均認可慢性腎衰為本虛標實之證，即慢性腎衰的發(fā)病以腎體不足為根本，邪實為標，可由外邪、飲食、勞倦、情志、藥毒蟲毒等外因誘發(fā)或加重。在本病發(fā)生過程中，首先存在腎體不足，或因本臟疾病所致，或因他臟疾病所累，逐漸進展至腎元虛損，腎用失司，濕濁內(nèi)生，瘀毒內(nèi)停，耗氣傷血，更傷腎元，因虛致實，又因?qū)嵏鼈?，形成惡性循環(huán)。

腎俞穴(BL 23)出自《靈樞·背俞》，足太陽膀胱經(jīng)經(jīng)穴，別名腎腧、腎之俞、少陰俞、腎念、高蓋等，為腎之背俞穴，是腎氣在背部輸注、轉(zhuǎn)輸之處。《難經(jīng)·六十七難》云:“五藏募皆在陰，而俞皆在陽者，何謂也？然陰病行陽，陽病行陰。故令募在陰，俞在陽”。《素問·陰陽應象大論》云：“善用針者，從陰引陽，從陽引陰”?！端貑枴た日摗罚骸爸尾卣咧纹溆幔胃咧纹浜稀?，對于五臟疾病，可選取本臟所對應的背俞穴進行治療，即腎俞穴。

“今夫五臟之有疾也，譬猶刺也，猶污也，猶結(jié)也，猶閉也?！蛏朴冕樥?，取其疾也，猶拔刺也，猶雪污也，猶解結(jié)也，猶決閉也。疾雖久，猶可畢也”(《靈樞·九針十二原》)，“十二俞，……皆通于臟氣”(《類經(jīng)》)。背俞穴為調(diào)節(jié)人體臟腑功能，振奮正氣之要穴,因而對于慢性腎衰本虛標實之證，腎俞穴當作為首選之腧穴?！侗怡o心書》云：“腎俞二穴，凡一切大病于此灸二三百壯，蓋腎為一身之根蒂，先天之真源，本牢則不死”。腎俞穴是腎之精氣聚集之處，為元氣之根，能夠培補并激發(fā)腎氣，以助腎臟氣化，促進津液代謝，升清降濁，運化得宜 。腎俞穴內(nèi)應腎臟，是腎臟經(jīng)氣輸注于背部之處，具有補腎納氣、健骨強筋、充耳益髓、固精斂澀、調(diào)經(jīng)止帶等多種功能。目前針對慢性腎衰的針刺治療研究多選用整組腧穴進行治療，少有單穴研究[7-9]。研究選毫針單獨針刺大鼠雙側(cè)腎俞穴，可培補腎元、扶助正氣，復其存精泄?jié)嶂?，以推動瘀濁之邪運化排出，如此則腎臟內(nèi)外之精微升降運化有序，諸臟得養(yǎng)，印證該穴對腎臟的直接調(diào)理作用。

腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)以細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積和間質(zhì)內(nèi)肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)的大量增生為特征，是各種慢性腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)[10]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1) 是目前已知的最強的致纖維化因子，是參與間質(zhì)纖維化最關(guān)鍵的細胞因子之一[11]。TGF-β1能夠通過TGF-β1/Smad信號通路誘導腎小管上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial to mesenchymal transition, EMT)[12]，EMT是腎小管上皮細胞失去其上皮細胞表型，細胞間的連接消失，細胞骨架重新構(gòu)建，細胞遷移及浸潤能力增強，最終轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的過程[13]，是導致RIF的重要機制之一；TGF-β1通過誘導EMT激活蛋白激酶C(PKCs)、氧化應激反應[14]和腎素血管緊張素系統(tǒng)[15]，致使ECM關(guān)鍵蛋白如纖維黏連蛋白、層黏連蛋白及I、III、IV等多種膠原合成增多，最終導致ECM大量沉積于腎間質(zhì), 腎間質(zhì)纖維化形成[16]。此外，TGF-β1能夠誘導腎間質(zhì)中成纖維細胞增殖并轉(zhuǎn)化為MFB[17]，MFB是導致ECM過度分泌的主要效應細胞；還能夠通過促進受損的腎小管上皮細胞凋亡引發(fā)腎小管萎縮[18]，最終導致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。

實驗結(jié)果顯示，針刺療法能夠降低模型大鼠的腎重體重比，降低腎臟肥大指數(shù)。在間質(zhì)纖維化方面，針刺組的TGF-β1表達較模型組顯著降低，經(jīng)針刺治療的大鼠血清中的Scr、BUN含量均明顯低于模型組，說明針刺療法能改善慢性腎衰患者的腎功能?？梢哉J為針刺大鼠“腎俞”穴能夠發(fā)揮“腎俞”穴對腎臟的直接調(diào)整作用，抑制TGF-β1在腎臟組織的表達，從而減輕ECM的堆積，改善腎臟微循環(huán)，減輕腎間質(zhì)纖維化程度，進而增強腎臟功能，延緩腎衰竭進展。

慢性腎衰病機錯綜復雜，治療困難，預后較差，雖然目前血液透析、腹膜透析及腎移植手術(shù)等療法為慢性腎衰的治療提供了新的途徑，對部分患者雖可獲得一定療效，延長了患者的生命，但由于存在費用昂貴、腎源不足及各種并發(fā)癥的問題，無法廣泛普及。所以就目前治療現(xiàn)狀來說，可以考慮將中醫(yī)治療與現(xiàn)代醫(yī)學療法相結(jié)合，充分發(fā)揮中醫(yī)整體辨證論治的特色和傳統(tǒng)針刺簡、便、驗、廉的優(yōu)勢，從而起到減少患者痛苦、延緩疾病進展、提高生活質(zhì)量、節(jié)省醫(yī)療資源的效果。