于瑞海， 王永旺， 張 哲， 馬培振， 李玲蔚， 孫長兵

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學),山東 青島 266003;2.東營市海盈水產(chǎn)品開發(fā)有限責任公司，山東 東營 257503)

小刀蟶(Cultellusattenuatus)隸屬軟體動物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)簾蛤目(Veneroida)刀蟶科(Cultellidae)，在我國南北方沿海均有分布[1]，是我國名貴貝類品種之一，小刀蟶作為新興的貝類養(yǎng)殖品種，具有生長速度快、營養(yǎng)豐富、價格昂貴等特點，具有較高的經(jīng)濟價值和產(chǎn)業(yè)開發(fā)前景。目前我國小刀蟶人工育苗總體上還處于試驗階段，關于小刀蟶的研究也比較少，主要集中在營養(yǎng)分析、遺傳多樣性、繁殖發(fā)育等方面。徐加濤等[2]對小刀蟶軟體的營養(yǎng)成分進行了分析，發(fā)現(xiàn)其軟體部具有較高的食用價值和保健作用；曾國權等[3]對小刀蟶群體內(nèi)同工酶的生化遺傳進行了分析，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)座位比例為52.38%，說明小刀蟶具有較強的遺傳變異能力；王亞等[4]對小刀蟶的性腺、胚胎以及幼體發(fā)育進行了較系統(tǒng)研究，姜緒等[5]對萊州灣小刀蟶繁殖生物學進行了系統(tǒng)研究，顧忠旗等[6]對小刀蟶進行室內(nèi)人工育苗研究，但出苗量極低。迄今為止，對于小刀蟶人工育苗的研究未見更多報道，育苗技術上存在親貝蓄養(yǎng)困難、難培養(yǎng)的問題，針對這一問題，作者對小刀蟶室內(nèi)育苗技術進行了改進和創(chuàng)新。2017年在萊州長漁水產(chǎn)有限公司進行了小刀蟶的人工育苗技術試驗，取得了人工育苗的成功,為其增殖放流及人工養(yǎng)殖工作的開展奠定了技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 育苗設施 實驗在萊州市長漁水產(chǎn)有限公司進行，育苗池規(guī)格為5.0 m×4.0 m×1.2 m，共20個。

1.1.2 親貝來源 小刀蟶采自山東省東營黃河三角洲自然海區(qū),從中挑選殼面完整、無機械損傷、軟體部飽滿的個體作親貝。育苗時使用親貝100 kg,平均殼長7.5 cm。

1.1.3 育苗水質(zhì)要求 自然海水經(jīng)沉淀、曝氣后，再通過2次砂濾后方可使用。培育期間水溫為自然海水溫度,pH 8.0～8.2,親貝蓄養(yǎng)期間鹽度26～30,幼蟲培育期間鹽度為26～30，稚貝培育期間定期投喂微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)水質(zhì)。

1.1.4 育苗期投喂的餌料種類 培育期間投喂的單胞藻有金藻(球等鞭金藻(Jsochrysisgalbana)3011、叉鞭金藻(Dirateriainornate))、小硅藻(Nitzschiaclosterium)、角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、扁藻(Platymonassubcordiformis)和小球藻(Chlorellavulgaris)等。

1.1.5 附著基選擇及處理 親貝蓄養(yǎng)期間的海泥和細沙均取自萊州市無污染海區(qū)，細沙經(jīng)150目篩絹過濾，海泥是經(jīng)200篩絹過濾，粒經(jīng)在50～100 μm，使用時經(jīng)10×10-6mol/L濃度的高錳酸鉀溶液消毒處理30 min后，沖洗2～3遍即可使用，而稚貝培育期間的海泥需用水煮沸消毒后再使用。

1.1.6 數(shù)據(jù)計算 肥滿度是按軟體部濕重與體重比值百分比；成活率是統(tǒng)計結束時成活個體數(shù)與統(tǒng)計開始時數(shù)量的百分比；產(chǎn)卵率是產(chǎn)卵排精親貝個數(shù)與育苗用總親貝數(shù)百分比。

1.2 方法

1.2.1 親貝培育 將上述處理好的小刀蟶親貝均勻放在池底鋪10 cm厚的海泥育苗池內(nèi)暫養(yǎng)，每天及時挑出不潛泥沙的親貝。培育密度80個/m2,培育水深80 cm,連續(xù)充氣。每日換水2次，每次換水量為總水體量的1/3～1/2；每日投喂6～8次，投喂種類為小硅藻和扁藻,日投餌量為小硅藻 (2～3)×105cell/mL、扁藻(2～4)×104cell/mL。并進行了小刀蟶親貝不同運輸方法及干露時間成活率以及親貝在鋪泥、鋪沙和半泥半沙3種底質(zhì)中培育情況的比較試驗。

1.2.2 親貝催產(chǎn)及孵化 采用陰干+升溫,陰干+氨海水浸泡法催產(chǎn)及陰干+復合維生素浸泡3種方法誘導產(chǎn)卵、排精,即將親貝從培育池內(nèi)撈起放入網(wǎng)箱里,沖洗其排泄物和污垢,陰干3 h,放入氨水濃度為0.005%海水中以及復合維生素濃度為0.005%海水浸泡2 h后,放入升溫3～4 ℃加滿過濾海水的育苗池里,微量充氣,0.5～1.0 h后即能產(chǎn)卵、排精。當受精卵達一定數(shù)量后,立即移到其他培育池中繼續(xù)產(chǎn)卵,然后進行1～2次的洗卵和分池孵化培育。

1.2.3 幼蟲培育 當受精卵發(fā)育到D形幼蟲時,立即用300目篩絹網(wǎng)選出進行培育,培育水溫為23～28 ℃,密度5～6個/mL。日換水2次,每次換水1/3～1/2培育水體,換水后投餌,殼頂幼蟲前期投喂金藻(2～3)×104cell/mL；殼頂幼蟲中后期混合投喂金藻(3～5)×104cell/mL和扁藻(0.5～1)×104cell/mL。鏡檢觀察幼蟲胃腸飽滿情況,并及時調(diào)整餌料投喂量。每日檢測幼蟲生長情況。

1.2.4 采苗與附著基的投放 當幼蟲培育到殼頂后期,此時幼蟲出現(xiàn)眼點,需要立即投附著基采苗，采苗時調(diào)整幼蟲密度1～2個/mL。采用2種方法采苗:有底質(zhì)采苗法,附著基底質(zhì)選擇當?shù)刈匀缓^(qū)灘涂上無污染的海泥(經(jīng)200目的篩絹過濾,粒徑50～100 μm),經(jīng)淘洗暴曬干燥后備用。使用時,將海泥用海水煮沸,冷卻后投入育苗池中,充氣均勻后停氣,充分沉淀待用，厚度為2～3 mm；并進行與無底質(zhì)采苗法和半泥半沙式采苗實驗。

1.2.5 稚貝培育管理 剛附著稚貝培育密度為(80～100)×104個/m2,1.0 mm稚貝培育密度為(30～40)×104個/m2。稚貝培育期間投喂單胞藻以扁藻、小球藻、角毛藻為主,金藻為輔，剛附著時日投喂量按金藻密度為(10～15)×104cell/mL,1～3 mm的稚貝日投喂量為度為(15～20)×104cell/mL,扁藻、小球藻和角毛藻按其大小換算。每日換水3次,每次換水量1/3培育水體,培育期間水溫22～30 ℃。

附著后每7～10 d進行一次移池疏養(yǎng),第一次和第二次分池的附著基為200目篩絹篩的海泥,厚度2～3 mm；從第三次分池開始,附著基改為100目篩絹篩的粒徑100～300 μm的海泥,厚度3～5 mm。并根據(jù)池底殘餌、污物多少,對海泥底質(zhì)進行更換并適時疏苗進行分池移養(yǎng)。期間開展無底質(zhì)上升流培育稚貝試驗和不同鹽度(15，20，25，30和35)下培育稚貝試驗。

2 結果與分析

2.1 親貝培育情況

經(jīng)過30 d的蓄養(yǎng)培育,小刀蟶親貝培育的成活率為70%,其死亡主要原因是采捕時和運輸時造成的傷害,因小刀蟶殼薄脆，運輸和起捕時很易受傷。不同運輸方法小刀蟶成活率分析見表1。

表1 小刀蟶親貝不同運輸方式成活率情況比較Table 1 Comparison on survival rate of Cultellus attenuatus in different transportation modes

注：同一列中上標具有不同字母表示差異較顯著(P<0.05)。

Note: Values in the same column with different superscripts are significantly different (P<0.05).

小刀蟶親貝在親貝蓄養(yǎng)期間，在0.2 m3的塑料水槽桶里各放了60個小刀蟶進行了不鋪沙和泥，鋪海泥，鋪半沙半泥，鋪細沙四類底質(zhì)培養(yǎng)30 d效果比較。不同底質(zhì)蓄養(yǎng)小刀蟶成熟效果比較如表2，其中培育初期肥滿度為40%。

表2 小刀蟶親貝不同底質(zhì)培養(yǎng)效果比較Table 2 Comparison on different sediments for Cultellus attenuatus parents

注：同一列中上標具有不同字母表示差異較顯著(P<0.05)。

Note: Values in the same column with different superscripts are significantly different (P<0.05).

①Comparative indicators;②Different sediments;③Without sand or mud;④With sea mud;⑤With half sand and half mud;⑥With fine sand;⑦Added Value rataio of Relative fatness;⑧Survival rate;⑨Spawning rate.

從表1看出,不鋪沙運輸?shù)男〉断|死亡率明顯高于鋪沙死亡率(P<0.05),這主要是小刀蟶殼薄,長途運輸中相互之間磨擦導致貝殼易碎,因此,小刀蟶親貝長途運輸必須鋪沙加冰,且冰不能直接加在親貝上。

從表2可以看出，經(jīng)過30 d不同底質(zhì)的培養(yǎng)條件下，小刀蟶親貝的肥滿度之間具有顯著差異(P<0.05)，其中鋪海泥底質(zhì)小刀蟶肥滿度增加值最大；鋪海泥和半泥半沙組的成活率顯著高于不鋪沙和泥組及鋪細沙組(P<0.05)，4種底質(zhì)培養(yǎng)條件下的產(chǎn)卵率均差異較大(P<0.05)。

2.2 催產(chǎn)與孵化

采用陰干+升溫法，陰干+氨海水浸泡+升溫法以及陰干+復合維生素浸泡+升溫法3種方法誘導小刀蟶親貝排精、產(chǎn)卵。受精卵卵徑為55～60 μm,屬沉性卵。在海水鹽度26的條件下,當水溫為23 ℃時,受精卵經(jīng)24 h發(fā)育到D形幼蟲。不同催產(chǎn)方法催產(chǎn)效果比較見表3。

表3 不同催產(chǎn)條件催產(chǎn)效果比較Table 3 Comparison on different spawning inductions

注：同一列中上標具有不同字母表示差異較顯著(P<0.05)。

Note: Values in the same column with different superscripts are significantly different (P<0.05).

由表3可見,3種誘導方法中，陰干+氨海水浸泡+升溫法的小刀蟶誘導產(chǎn)卵的效果最好，其次是陰干+復合維生素浸泡+升溫法，最差是陰干+升溫法，孵化率是陰干+升溫法和陰干+復合維生素浸泡+升溫法最好，陰干+氨海水浸泡+升溫法孵化率差些，但也較高。從生產(chǎn)角度考慮，陰干+氨海水浸泡+升溫法誘導最佳。

2.3 幼蟲培育

在鹽度30、投喂金藻的條件下,D形幼蟲生長發(fā)育速度隨水溫不同而變化，在26 ℃幼蟲生長發(fā)育進程如圖1 所示。

從圖1可以看出,D形幼蟲經(jīng)10 d生長發(fā)育到眼點幼蟲,此時幼蟲殼長在265～270 μm，D形幼蟲平均殼長日增長為20 μm左右。

圖1 小刀蟶幼蟲殼長生長情況Fig.1 Growth of Cultellus attenuatus larvae

2.4 附著采苗

當幼蟲發(fā)育至265 μm時，60%幼蟲出現(xiàn)眼點,進入附著變態(tài)前期,立即將幼蟲投放到已投放海泥附著基的培育池中,觀察到部分面盤萎縮;殼長生長至320～350 μm時,面盤脫落,變態(tài)后營匍匐生活；在水溫25～28 ℃條件下,再經(jīng)15～20 d的培育,幼苗可生長到1 000 μm左右,此階段稚貝殼長日生長量為50～60 μm。無底質(zhì)和有底質(zhì)附苗效果比較如表4所示。

表4 小刀蟶眼點幼蟲附著變態(tài)情況表Table 4 Collection and metamorphism of Cultellus attenuatus eyespot larvae in different sediments

從表4可以看出,無底質(zhì)采苗在變態(tài)率和采苗數(shù)量與純海泥底質(zhì)采苗沒有差異，比半沙半泥以及純海沙高；但在采苗后生長速度方面無底質(zhì)生長速度大大慢于海泥底質(zhì)培育的生長速度，因此無底質(zhì)采苗適合培育殼長小于500 μm前的培育，海泥底質(zhì)在后期培育方面，在生長速度和成活率方面適合大規(guī)格苗種的培育。

2.5 稚貝培育

2.5.1 小刀蟶稚貝上升流培育模式試驗 在小刀蟶稚貝培育過程中,進行了無底質(zhì)上升流培育15 d后稚貝生長、成活效果與有底質(zhì)培育效果的比較實驗,其結果見圖2、3。

從圖2和3可以看出,小刀蟶稚貝在15 d上升流培育過程中,殼長生長速度稍慢于對照組稚貝的生長速度,但差異不明顯；而無底質(zhì)上升流成活率明顯低于有底泥培養(yǎng)的對照組,差異明顯,因此,1 000 μm以上的小刀蟶稚貝不適宜上升流培育模式,小刀蟶稚貝的培育需有一定厚度的底泥附著基培育。

從圖3可以看出,小刀稱稚貝在15 d上升流培育過程中,前5 d的成活率可維持在80%以上,但第10天的成活率大幅下降,僅為45%,15 d的成活率僅為15%。因此,小刀蟶稚貝(殼長大于1.0 mm以上)培育不適合無底質(zhì)上升流培育模式,必須在有泥沙質(zhì)底質(zhì)中培育。

圖2 小刀蟶稚貝殼長在上升流培育過程中生長情況(P<0.05)Fig.2 Growth of Cultellus attenuatus juveniles in upwelling flow (P<0.05)

2.5.2 小刀蟶在不同鹽度下培育條件下生長比較 小刀蟶稚貝在泥底和不同鹽度15,20,25,30,35,培育15 d稚貝生長情況比較試驗,其結果見圖4、5。

圖3 小刀蟶稚貝在上升流培育過程中成活情況(P<0.05) Fig. 3 Survival rate of Cultellus attenuatus juveniles in upwelling flow (P<0.05)

圖4 小刀蟶稚貝在不同鹽度下生長比較Fig.4 Comparison on the growth of Cultellusattenuatus juveniles in different salinities

圖5 小刀蟶稚貝不同鹽度下成活率比較Fig.5 Comparison on the survival rate of Cultellusattenuatus juveniles in different salinities

從圖4可看出,小刀蟶稚貝適宜培育的鹽度為15,其次是20和30,最差是35,鹽度15與其它鹽度差異顯著,其它鹽度之間差異不顯著,鹽度35生長較好,主要是死亡率高，培育密度大幅下降造成的。

從圖5可看出,鹽度15的成活率最好,20次之,35最低,而且它們之間差異顯著(P<0.05)。

綜上所述,小刀蟶稚貝適宜鹽度15～20，生長速度最快,成活率最高。

2.5.3 小刀蟶育苗情況 經(jīng)過30 d的培育，將1 mm的稚貝培育至2～3 mm，每天換水2次,每次1/2個水體,投餌8次,日投喂量(15～20)×104cell·mL·d-1,8～12 d移池1次,按照此培育過程,稚貝成活率可達60%以上,培育出3 mm以上的商品苗2 000萬粒，取得比較好的育苗效果。

3 討論

3.1 親貝運輸及室內(nèi)蓄養(yǎng)培育的問題

小刀蟶在運輸過程中，由于小刀蟶外殼較薄脆，受到?jīng)_擊和擠壓易斷裂或殼碎，從而造成小刀蟶傷害和死亡，是引起死亡的主要原因，因此，我們嘗試小刀蟶親貝在運輸前和細沙混在一起，可以大大降低親貝之間擠壓或摩擦造成的傷害，運輸成活率大大提高。這與薄片鏡蛤(Dosinialaminata)[7]、四角蛤蜊(Mactraveneriformis)[8]、中國仙女蛤(CallistachinensisHolten)[9]、庫頁島蛤蜊(Pseudocardiumsachalinense)[10]等生活環(huán)境為泥沙底的貝類親貝運輸成活率高明顯不同，主要是與這些貝類殼較硬，耐積壓有關系,而與大竹蟶(Solengrandis)[11]因生活底質(zhì)為沙質(zhì)底,殼大比較硬,也比較耐積壓有關。

親貝培育是育苗的關鍵，通過多年取樣調(diào)查和解剖性腺觀察發(fā)現(xiàn),山東黃河三角洲沿海小刀蟶自然繁殖季節(jié)為6月，根據(jù)本研究也可以在繁殖季節(jié)前，提早入池通過室內(nèi)升溫促熟培育產(chǎn)卵，小刀蟶適宜做親貝的規(guī)格為殼長6～8 cm,個體活力好且排卵量大,能獲得大批優(yōu)質(zhì)受精卵。

小刀蟶親貝蓄養(yǎng)發(fā)育慢、死亡率較高,除了與運輸有關外，另一原因是親貝蓄養(yǎng)必須在有純海泥底質(zhì)中和有少量細沙的泥沙質(zhì)底泥中培育，純沙底質(zhì)成活率較低的原因是小刀蟶殼薄，潛沙后對殼和軟體部及足的傷害較大，引起死亡，這也是小刀蟶為何必須用海泥做附著基、與大竹蟶親貝蓄養(yǎng)底質(zhì)不同的主要原因[11-12]。而小刀蟶用海泥做附著基，海泥極易引起水質(zhì)變化，所以，在海泥中加小量的細沙、加大換水和勤更換底泥是保證其親貝蓄養(yǎng)成活率的關鍵。

3.2 適宜誘導小刀蟶產(chǎn)卵適宜方法的問題

目前誘導扇貝、牡蠣產(chǎn)卵、排精的方法主要是陰干、升溫法，在生產(chǎn)中小刀蟶采用此法效果較差，我們按照中國仙女蛤、庫頁島蛤蜊、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)和縊蟶(Sinonovacullaconstricta)育苗[9-10, 13-14]中使用陰干、升降溫及氨海水浸泡的方法，和我們改進的陰干、復合維生素浸泡法，誘導效果明顯比陰干、升溫刺激及氨海水浸泡法好，基本解決了小刀蟶產(chǎn)卵的問題，而且對親貝刺激較少，受精卵孵化率高,這主要是因維生素和氨海水能促進卵細胞成熟,經(jīng)陰干和升溫刺激就可以大批產(chǎn)卵、排精,這與王昭萍[15]和邸偉鵬[16]在牡蠣和扇貝體外促熟培育中使用的維生素和氨海水的原理相一致。在誘導產(chǎn)卵方法選擇上，首先要保證產(chǎn)出更多質(zhì)量好的卵子，孵化率高，其次對種貝傷害少，誘導后種貝活力可迅速恢復。不管哪種方法誘導催產(chǎn)，都要根據(jù)親貝性腺的成熟程度來掌握，要因種和發(fā)育程度而定，發(fā)育程度好易催產(chǎn)，發(fā)育程度差，即使使用多種方法催產(chǎn)也不成功，甚至把不成熟卵子催出，受精率、孵化率也較低，不利于幼蟲培養(yǎng)，因此，催產(chǎn)要根據(jù)種貝性腺的發(fā)育情況而定。

3.3 不同附著基采苗效果探討

采苗時機和如何采苗是提高附著變態(tài)率的關鍵。本育苗過程中，主要采用4種采苗方法。第一種是無底質(zhì)采苗，池中和池底部不放任何附著基,優(yōu)點是水質(zhì)好、眼點幼蟲變態(tài)率高，但附著變態(tài)后10 d內(nèi)，需轉(zhuǎn)入鋪海泥的育苗池中，這樣才能保證稚貝生長快和成活率高，與孔寧對庫頁島蛤蜊[9]研究的結果一致；第二種是池底鋪海泥采苗，池底鋪有2～3 mm厚的海泥，海泥必須經(jīng)過200目篩絹過濾并水煮后方可使用，雖然附著變態(tài)率較無底質(zhì)稍差，但生長速度較快，并一直可以培育到商品規(guī)格，但不易長時間培養(yǎng)使用，需要經(jīng)常更換海泥底質(zhì)；第三種是半沙半泥底質(zhì)采苗，采苗效果也比較好，但移池、篩苗由于沙的存在，易造成稚貝殼碎，引起死亡，稚貝培育死亡率較高；第四種是采用純沙采苗培育，雖然稚貝干凈，但不宜移池和分苗，死亡率也很高，從采苗效果、生長速度、生產(chǎn)操作和不傷害稚貝等方面考慮，純海泥底質(zhì)采苗效果和培育效果最好，這一結果與閆喜武在薄片鏡蛤[7]、趙玉明[17]在青蛤(Cyclinasinensis)育苗采用海泥附著基采苗效果一致，而與李長松[18]在青蛤、陳志在雙線血蛤(Sanguinolviadiphos)[19]研究的底質(zhì)對稚貝生長影響結果相似。

3.4 小刀蟶稚貝不同培育模式和鹽度試驗探討

小刀蟶稚貝培養(yǎng)時需在育苗池底部加入一定量的海泥底質(zhì)進行培養(yǎng)。在實際生產(chǎn)過程中，海泥底質(zhì)容易腐敗，易造成小刀蟶稚貝的死亡，因此要不斷的更新底質(zhì)。又因小刀蟶稚貝殼薄，在更換底質(zhì)時容易造成小刀蟶稚貝的損傷，增加死亡率。因此，本實驗進行了無底質(zhì)上升流培育實驗。根據(jù)我們的試驗，小刀蟶稚貝在1 mm以上,采用無底質(zhì)的上升流培育模式,死亡率特別高,因此,此法不適合小刀蟶稚貝培育,應探討新的培育模式方法。

根據(jù)我們的鹽度試驗,小刀蟶稚貝在低鹽生活條件下,生長速度和成活率高,這和其親貝生活環(huán)境和習性有關,也和顧忠旗[6]的實驗結果一致,而鹽度35生長速度快于20，25和30,主要是因為其死亡率高,剩下的培育密度低于其它鹽度組,造成生長速度快于其它組,而低于15鹽度組，這一結果與曹伏軍[20]在文蛤稚貝培育、桑士田[21]在菲律賓蛤仔稚貝培育的鹽度實驗相似，主要這二種貝類與小刀蟶的生活環(huán)境相似有關。

因此，針對小刀蟶稚貝的特點，探討一種新的稚貝培育模式和方法是下一步研究的重點之一。

4 結語

本研究通過對小刀蟶的親貝運輸、室內(nèi)促熟培育、人工誘導產(chǎn)卵、幼蟲培育、采苗和稚貝培育的研究，初步解決了小刀蟶室內(nèi)人工育苗的技術問題。按照此培育方法操作, 小刀蟶親貝的成活率可達70%，稚貝培育成活率可達60%以上,本研究成功培育出3 mm以上商品苗2 000萬粒，為小刀蟶規(guī)模化人工育苗和增養(yǎng)殖奠定了基礎。