宋協(xié)法， 楊曉晗， 黃志濤

(中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003)

氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中常見的污染物，其中氨氮主要源于養(yǎng)殖魚類排泄物和殘餌，通過(guò)硝化細(xì)菌作用轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，最終轉(zhuǎn)化為硝酸鹽。氨氮和亞硝酸鹽對(duì)魚類的毒性較強(qiáng)，一般認(rèn)為硝酸鹽對(duì)于水產(chǎn)品不具毒性或毒性較低[1]，其對(duì)魚類潛在的影響往往被水產(chǎn)從業(yè)者所忽視但在高密度循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中硝酸鹽迅速積累，能夠達(dá)到200 mg/L或更高[2]。近年來(lái)，硝酸鹽對(duì)養(yǎng)殖魚類的潛在影響逐步受到學(xué)者的重視。本文總結(jié)了硝酸鹽對(duì)海水和淡水魚類急性、亞急性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，闡述了硝酸鹽對(duì)魚類的毒性作用機(jī)理及硝酸鹽脅迫對(duì)魚類生長(zhǎng)、存活和生理等方面的影響，以期引起水產(chǎn)從業(yè)者重視養(yǎng)殖水體中硝酸鹽濃度對(duì)魚類的影響，并為工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)硝酸鹽濃度的調(diào)控提供參考。

1 硝酸鹽的來(lái)源和毒性機(jī)理

硝酸鹽是含氮有機(jī)物硝化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，具有低毒性。集約化工廠化養(yǎng)殖系統(tǒng)中魚類的殘餌和排泄物礦化產(chǎn)生氨氮，并在生物濾池中硝化細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，最終轉(zhuǎn)化成硝酸鹽，在沒有反硝化環(huán)節(jié)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，硝酸鹽會(huì)逐漸積累。

2 影響硝酸鹽毒性的因素

目前研究結(jié)果顯示，影響硝酸鹽毒性的因素主要包括鹽度、溫度、硬度、硝酸鹽濃度、硝酸鹽的暴露時(shí)間等。

3 硝酸鹽對(duì)魚類急性毒性影響

由于淡水和海水中氯離子濃度的差異，一般認(rèn)為海水魚類對(duì)硝酸鹽具有較高的容忍能力，鉤嘴鰨(Heteromycteriscapensis)24 h半數(shù)致死濃度高達(dá)5 050 mg/L，石頜鯛(Lithognathusmormyrus)和重牙鯛(Diplodussaegus)也分別達(dá)到3 550和3 560 mg/L[18]。我們對(duì)海水魚類大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)和斑石鯛(Oplegnathuspunctatus)進(jìn)行了硝酸鹽急性毒性實(shí)驗(yàn)，硝酸鹽24 h的LC50分別為2 741和484 mg/L(未發(fā)表數(shù)據(jù))，可見并非所有的海水魚類的硝酸鹽耐受能力都高于淡水魚類。

4 硝酸鹽對(duì)魚類慢性毒性影響

4.1 硝酸鹽對(duì)魚類生殖發(fā)育的影響

硝酸鹽影響魚類生殖發(fā)育和內(nèi)分泌激素的分泌，Shimura等研究發(fā)現(xiàn)硝酸鹽濃度為75 mg/L時(shí)，青鱂(Oryziaslatipes)受精和孵化成功率大大降低，孵化時(shí)間延長(zhǎng)；當(dāng)硝酸鹽濃度高于100 mg/L時(shí)雌性青鱂存活率突然降低，僅為20%[36]。McGurk等發(fā)現(xiàn)高濃度硝酸鹽處理組(100和400 mg/L)中鯡形白鮭(Coregonusclupeaformis)成功孵化個(gè)體規(guī)格顯著小于低處理組(1.6，6.25和25 mg/L)[28]。而Good等對(duì)大西洋鮭(Salmosalar)((102±1)g)進(jìn)行了為期8個(gè)月的硝酸鹽暴露實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組血漿激素濃度差異不顯著，認(rèn)為硝酸鹽濃度為100 mg/L時(shí)，不會(huì)對(duì)大西洋鮭性成熟產(chǎn)生消極影響[37]。

有觀點(diǎn)認(rèn)為硝酸鹽在魚類血液中可以分解出NO，NO具有兩相性，即低濃度促進(jìn)、高濃度抑制激素產(chǎn)生，NO可以與P450酶的亞鐵血紅素位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，破壞P450酶的催化作用，從而直接對(duì)激素水平造成影響，進(jìn)而影響魚類性成熟[7-8]。Freitag等發(fā)現(xiàn)高濃度處理組(101.8 mg/L)大西洋鮭(Salmosalar)(102 g左右)血漿硝酸鹽含量是中間濃度組(10.3 mg/L)的14倍，是低濃度組(5.2 mg/L)的23倍，且硝酸鹽處理會(huì)顯著影響大西洋鮭血漿睪酮濃度[9]。Hamlin等進(jìn)行西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)(4 kg)硝酸鹽(50和250 mg/L)暴露實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽會(huì)影響類固醇激素水平，高濃度組西伯利亞鱘血漿T、11-KT和E2(雌二醇)均顯著高于低濃度組[38]。Schram等發(fā)現(xiàn)非洲鯰魚(Clariasgariepinus)血漿硝酸鹽濃度隨水體硝酸鹽濃度升高而升高，高濃度處理(378 mg/L)鯰魚血漿硝酸鹽濃度是對(duì)照組的93倍，各組間血細(xì)胞數(shù)、血漿皮質(zhì)醇、葡萄糖、乳酸沒有顯著差異[22]；梭鱸(Sanderlucioperca)(27g)血漿硝酸鹽濃度也隨著養(yǎng)殖水體硝酸鹽濃度升高而升高，當(dāng)硝酸濃度高于50 mg/L時(shí)，魚類血漿中激素含量會(huì)發(fā)生顯著變化[39]。

中文名Name學(xué)名Species養(yǎng)殖水體Aquaticmedium規(guī)格Developmentalstage毒性參數(shù)NO-3-NToxicologicalparameter NO-3-N/mg·L-1虹鱒Oncorhynchus mykissFreshwater1～9 g1 355(96 h LC50)[26]Freshwater0.3～0.6 g1 913(96 h LC50)[17]湖紅點(diǎn)鮭Salvelinus namaycushFreshwater1～10 d age1 121(96 hLC50)[28]鯡形白鮭Coregonus clupeaformisFreshwater1～4 d age1 903(96 hLC50)[28]大馬哈魚Oncorhynchus tshawytschaFreshwater1 310(96 hLC50)[26]鯧參魚Florida pompano1 006(96 h LC50)[16]黑鱸Micropterus treculiFreshwater0.1 g143(96 hLC50)[24]藍(lán)鰓太陽(yáng)魚Lepomis macrochirusFreshwater1 975(96 hLC50)[25]斑點(diǎn)叉尾鮰Ictalurus punctatusFreshwater50～76 mm(22 ℃)1 355(96 hLC50)[16]Freshwater50～76 mm(22 ℃)1 423(96 hLC50)[16]Freshwater50～76 mm(22 ℃)1 400(96 hLC50)[16]西伯利亞鱘Acipenser baeriFreshwater(6.90±0.31) g1 510(24 hLC50)[27]Freshwater(6.90±0.31) g1 443(48 hLC50)[27]Freshwater(6.90±0.31) g1 195(72 hLC50)[27]Freshwater(6.90±0.31) g1 028(96 hLC50)[27]Freshwater(66.9±3.4) g601(96 hLC50)[27]Freshwater(673.8±18.6) g803(24 hLC50)[27]Freshwater(673.8±18.6) g522(48 hLC50)[27]Freshwater(673.8±18.6) g438(72 hLC50)[27]Freshwater(673.8±18.6) g397(96 hLC50)[27]胭脂魚mullet Mugil platanus Freshwater1 522(96 h LC50)[29]斑馬魚Danio rerioFreshwaterEmbryos(3 hpf)1 606(96 hLC50)[30]FreshwaterNewly-hatched larvae(72 hpf)1 987(96 hLC50)[30]FreshwaterSwim-up larvae(120 hpf)1 250(96 hLC50)[30]托普美州Notropis topekaAdult(66.2 mm)1 559(96 hLC50)[31]Juvenile(46.3 mm)1 354(96 hLC50)[31]鯉魚 Cyprinus carpio Freshwater5～6 g,1 075.1(96 hLC50)(Static)[32]Freshwater5～6 g967.63(96 hLC50)(Continuous flow through)[32]Freshwater(36.8±5.3) g995(96 hLC50)(KNO3)[33]Freshwater(36.8±5.3) g865(96 hLC50)(KNO3)[33]卡特拉魚Catla catlaFreshwater1 565(24 hLC50)(Static)[34]Freshwater1 484(24 hLC50)(Continuous flow through)[34]黑頭呆魚Pimephales promelasFreshwater<8 d old1 341(96 hLC50)[23]

續(xù)表1

中文名Name學(xué)名Species養(yǎng)殖水體Aquaticmedium規(guī)格Developmentalstage毒性參數(shù) NO-3-NToxicologicalparameter NO-3-N/mg·L-1Freshwater2 110(24 h LC50)[11]Freshwater761(24 h LC50)[11]花鱂Poecilia reticulatusFreshwater267(24 hLC50)(KNO3)[21]Freshwater219(48 h LC50)(KNO3)[21]Freshwater199(72 h LC50)(KNO3)[21]Freshwater191(96 h LC50)(KNO3)[21]斑石鯛Oplegnathus punctatusSeawater484.5(24 h LC50)Seawater678.8(48 h LC50)Seawater586.3(72 h LC50)Seawater774.4(96 h LC50)大瀧六線魚Hexagrammos otakiiSeawater(1.9±0.7)g2741(24 h LC50)Seawater2 413(48 h LC50)Seawater2 357(72 h LC50)Seawater2 339(96 h LC50)軍曹魚Rachycentron canadum Seawater (6.87±0.36)g2 661(12 h LC50)[35]Seawater (6.87±0.36) g2 407(24 h LC50)[35]Seawater (6.87±0.36) g2 071(48 h LC50)[35]Seawater (6.87±0.36) g2 028(72 h LC50)[35]Seawater (6.87±0.36) g1 829(96 h LC50)[35]石頜鯛Lithognathus mormyrusSeawater 3 450(24 h LC50)[18]重牙鯛Diplodus saegusSeawater 3 560(24 h LC50)[18]鉤嘴鰨Heteromycteris capensis Seawater 5 050(24 h LC50)[18]

硝酸鹽對(duì)魚類生殖毒性主要體現(xiàn)于影響魚卵質(zhì)量，不會(huì)影響已性成熟魚性激素分泌。而血漿硝酸鹽濃度隨養(yǎng)殖水硝酸鹽濃度升高而升高，這是和魚類吸收硝酸鹽的途徑有關(guān)，無(wú)論是通過(guò)擴(kuò)散，還是魚鰓吸收，均為被動(dòng)吸收，因此血漿硝酸鹽濃度和環(huán)境濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，但硝酸鹽與激素分泌調(diào)節(jié)酶的關(guān)系尚不明確。

4.2 硝酸鹽對(duì)魚類組織器官的影響

魚鰓在不利的水質(zhì)環(huán)境下會(huì)第一時(shí)間作出反應(yīng)，魚類受到高濃度硝酸鹽脅迫時(shí)，肝臟的反應(yīng)最為明顯，通常作為水生生物毒性實(shí)驗(yàn)的重要生物檢驗(yàn)指標(biāo)[39-40]。Shimura等發(fā)現(xiàn)高濃度硝酸鹽(125 mg/L)會(huì)引起青鱂(Oryziaslatipes)鰓細(xì)胞增生和壞死，肝細(xì)胞間出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象[41]；Ricardo等發(fā)現(xiàn)當(dāng)硝酸鹽濃度高于1500 mg/L時(shí)，軍曹魚(Rachycentroncanadum)出現(xiàn)鰓上皮細(xì)胞增生的現(xiàn)象，鰓部毛細(xì)血管擴(kuò)張，降低了魚類氧氣吸收的能力，引起窒息現(xiàn)象[35]。Iqbal等將鯉魚(Cyprinuscarpio)(36.8 g)養(yǎng)殖在硝酸鹽濃度為168 mg/L的水體中，32 d后發(fā)現(xiàn)鯉魚肝細(xì)胞出現(xiàn)萎縮、細(xì)胞膜呈現(xiàn)鋸齒邊緣化、肝脂肪細(xì)胞變性等現(xiàn)象，腎臟同樣受損，腎小球衰退，細(xì)胞中出現(xiàn)無(wú)規(guī)則空泡，腎小管上出現(xiàn)了大片的光斑，腎小管之間造血組織大量增生[33]。然而，Good等研究發(fā)現(xiàn)高硝酸鹽濃度處理組(99 mg/L)的大西洋鮭(Salmosalar)心臟、脾臟、肝臟、腎臟和肌肉等組織未出現(xiàn)損傷現(xiàn)象[37]；Frankes和Hoff發(fā)現(xiàn)在500 NO3--N mg/L處理下小丑魚(Amphiprionocellaris)肝臟沒有呈現(xiàn)損傷狀況[42]。

魚類暴露在高濃度硝酸鹽條件下，通常會(huì)對(duì)魚類的甲狀腺淋巴結(jié)、鰓和肝臟等呼吸、解毒器官造成不同程度的損傷，一般體現(xiàn)在鰓部毛細(xì)血管擴(kuò)張、鰓細(xì)胞增生、肝細(xì)胞產(chǎn)生空泡等現(xiàn)象。但也有研究中發(fā)現(xiàn)高濃度硝酸鹽并沒有對(duì)相關(guān)器官造成不良影響，說(shuō)明物種差異可能是導(dǎo)致硝酸鹽毒性差異的原因，其對(duì)魚類組織器官內(nèi)在的影響機(jī)理還應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4.3 硝酸鹽對(duì)魚類形態(tài)外觀、魚類行為的影響

4.4 硝酸鹽對(duì)魚類生長(zhǎng)存活的影響

然而Knepp和Arkin沒有發(fā)現(xiàn)高濃度硝酸鹽(90 mg/L)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)生長(zhǎng)和攝食產(chǎn)生影響[47]；同樣的，F(xiàn)reitag也發(fā)現(xiàn)不同硝酸鹽濃度處理組(10.5和101.8 mg/L)之間大西洋鮭(Salmosalar)體重未呈現(xiàn)顯著差異[9]。2011年，Davidson等人發(fā)現(xiàn)不同濃度硝酸鹽(13和99 mg/L)處理下虹鱒(Oncorhynchusmykiss)(150 g)生長(zhǎng)率差異不顯著，不會(huì)對(duì)存活率(分別為93.1%和93.3%)產(chǎn)生影響[43]。2014年，Davidson等通過(guò)對(duì)虹鱒((16.4±0.3)g)為期3個(gè)月的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽(30和91 mg/L)處理對(duì)虹鱒體長(zhǎng)、體重、生長(zhǎng)率和餌料系數(shù)(FCR)均無(wú)影響，存活率分別為92.5%和87.9%[48]。Torno等認(rèn)為200和500 mg/L硝酸鹽處理均不會(huì)影響歐洲海鱸(Dicentrarchuslabrax)的存活和生長(zhǎng)[49]。

硝酸鹽對(duì)魚類的生長(zhǎng)的影響可能存在一定的臨界濃度，通過(guò)實(shí)驗(yàn)找到相應(yīng)魚類的安全濃度可有效降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，很多研究結(jié)果顯示高濃度硝酸鹽不利于魚類生長(zhǎng)，甚至引起魚類的死亡，可能是由于魚類利用較多能量抵抗硝酸鹽毒性，因而同一實(shí)驗(yàn)魚的生長(zhǎng)率隨養(yǎng)殖水硝酸鹽濃度升高而降低。由于硝酸鹽毒性相比亞硝酸鹽和氨氮較低，且受魚種及魚體大小影響大，各研究中存活率波動(dòng)較大，具體硝酸鹽對(duì)于魚類生長(zhǎng)存活的毒性仍需進(jìn)一步研究。

5 研究展望

硝酸鹽對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的潛在危害已經(jīng)引起了國(guó)外水產(chǎn)研究者的重視。但在國(guó)內(nèi)卻鮮有關(guān)注，目前可查的僅有付騰等關(guān)于硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性研究[50]，實(shí)驗(yàn)表明硝酸鹽會(huì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的肝臟、肌肉等組織產(chǎn)生損傷。常規(guī)的養(yǎng)殖過(guò)程中硝酸濃度相對(duì)較低，但在高密度循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中硝酸鹽逐漸積累，往往能夠達(dá)到200 mg/L以上，針對(duì)于國(guó)內(nèi)外均進(jìn)行循環(huán)水養(yǎng)殖的魚類品種，我們應(yīng)該借鑒數(shù)據(jù)確定硝酸鹽安全濃度，并在此基礎(chǔ)之上，結(jié)合國(guó)內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖的特點(diǎn)對(duì)我們特有的養(yǎng)殖品種進(jìn)行硝酸鹽安全濃度的確定。

(1)開展硝酸鹽毒性機(jī)理研究。硝酸鹽對(duì)養(yǎng)殖魚類的毒性影響研究主要停留在感官、生理及行為層面，對(duì)魚類的毒性機(jī)理還存在著爭(zhēng)議，應(yīng)開展魚類吸收硝酸鹽的途徑研究，進(jìn)一步明確硝酸根離子在魚體內(nèi)的運(yùn)輸路徑，借助分子生物學(xué)技術(shù)從分子層面揭示硝酸鹽的毒性機(jī)理，解釋硝酸鹽影響黃蛋白原、睪酮激素等性激素的機(jī)理，研究高濃度硝酸鹽的養(yǎng)殖水體對(duì)魚類遺傳進(jìn)化的影響，將有助于更全面、系統(tǒng)的了解硝酸鹽的毒性影響。

(2)開展環(huán)境因子對(duì)硝酸鹽毒性影響研究。養(yǎng)殖水體鹽度、硬度、pH、溫度、溶解氧等參數(shù)均可能影響硝酸鹽對(duì)魚類的毒性，在不同的水質(zhì)參數(shù)條件下魚類對(duì)硝酸鹽的LC50有所區(qū)別，應(yīng)關(guān)注養(yǎng)殖水體物理化學(xué)指標(biāo)變化，注意區(qū)分硝酸鹽對(duì)淡水魚，海水魚以及廣鹽性魚類毒性研究，開展不同水質(zhì)環(huán)境條件下硝酸鹽對(duì)養(yǎng)殖魚類的毒性影響研究，確定不同水質(zhì)條件下硝酸鹽的安全濃度，指導(dǎo)實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中的硝酸鹽濃度控制。